第四节 宿主来源的硫化氢在结核发病机制中的作用
硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）激活结核分枝杆菌的呼吸、生长及致病作用
2020年1月来自美国的Adrie J.C.Steyn团队在Nature Communication杂志上发表了一篇关于H2S参与Mtb持留作用的最新研究报道。Mtb是一种古老的胞内致病菌，可以在人体内长期潜伏存在，阐明影响Mtb存活的宿主因素对揭示其持留机制至关重要。近来，H2S作为一种新型信号分子参与了多种病理生理学过程，并且它与一氧化碳和一氧化氮具有功能交叉性。哺乳动物中H2S主要通过胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase，3-MST）酶促反应产生。研究报道发现H2S通过调控线粒体呼吸使小鼠进入一种休眠状态；在哺乳动物中，H2S以浓度依赖的方式对线粒体呼吸进行双向调控，高浓度H2S抑制线粒体上细胞色素氧化酶的活性，而低浓度H2S可以促进线粒体呼吸作用。
（1）目的：
在缺失CBS（CBS+/-）的小鼠模型中开展Mtb感染实验，检测CBS在炎症反应中的作用，鉴定感染小鼠模型中H2S的水平，研究H2S如何调控Mtb生长、基因表达、代谢及呼吸作用。
（2）方法：
H37Rv标准株，Mtb cydC：aph，Mtb ΔdosS，ΔdosT和ΔdosS/dosT突变株。构建Mtb感染小鼠模型；AOAA/GYY4137处理小鼠；小鼠肺部病变的组织学分析；细胞因子分析；小鼠巨噬细胞分离；RT-PCR；免疫印迹；流式细胞技术；生物能分析（Seahorse XF96分析仪或Oroboros Oxygraph-2k）；菌体总ATP定量分析：活性氧产物水平检测；液质联用LC-MS/MS靶向代谢物分析；不同组分营养成分贡献度分析（fractional nutrient contribution，FNC）；硝酸盐/亚硝酸盐估算；亚甲蓝法测定硫化物；WSP-1荧光探针法测定H2S；氧化压力试验；阿拉玛蓝分析；RNA提取及测序等。RNA测序数据上传至EMBL-EBI ArrayExpress数据库（E-MTAB-7421）。
（3）结果：
用Mtb H37Rv感染小鼠RAW 264.7巨噬细胞系引起CBS蛋白质表达水平上升34倍。在缺陷型小鼠（Cbs+/-）中，CBS蛋白质水平下降约50%，而Mtb感染野生型小鼠（WT）导致外周血巨噬细胞CBS表达水平增加25倍，但CSE和3-MST水平不受影响。与Mtb感染的WT小鼠相比，Cbs+/-小鼠的外周血巨噬细胞中Mtb存活率下降，同时伴随着H2S水平的降低，用H2S供体化合物GYY4137处理后，Mtb菌株存活率明显升高。这表明，Mtb的存活率主要与H2S水平相关。
与Mtb感染的WT小鼠相比，Cbs+/-小鼠存生存时间更长（Cbs+/-：286天；WT：211天），并且Mtb感染Cbs+/-小鼠8周和14周后，肺和脾的荷菌量都有所降低，同时伴随着肺部损伤程度的减轻。结果表明，CBS的存在可以上调H2S水平，并从宿主生存率和携菌量两个方面促进结核病病情恶化。
检测Mtb感染WT小鼠和Cbs+/-小鼠后免疫细胞组成及比例、炎性细胞因子水平及Th1/Th2应答反应，结果显示受感染的Cbs+/-小鼠生存率增加及荷菌量的降低不单单是由于宿主免疫应答反应的显著差别，而更可能与H2S对Mtb的直接作用有关。
通过体外实验检测Mtb感染巨噬细胞系的Mtb存活率发现，低水平的硫化产物（5、10和25µM GYY4137处理）以剂量依赖的方式促进Mtb生长。体内实验检测ATP的合成及氧气消耗比例（oxygen consumption rate，OCR）发现，低剂量的H2S可以通过作用于Mtb的电子传递链（electron transport chain，ETC）提高呼吸作用及ATP水平促进Mtb生长。
采用液相色谱质谱法（LC-MS/MS）对GYY4137处理后Mtb菌体内代谢物进行分析发现，糖酵解中间产物6-磷酸葡萄糖、1，6-二磷酸果糖和丙酮酸的水平升高。碳示踪数据表明H2S暴露后，Mtb通过糖酵解、戊糖磷酸途径和三羧酸循环中能量流的增强来提高Mtb能量代谢和合成代谢底物中间体，最终促进菌体生长。
采用缺失细胞色素bd型甲萘酚氧化酶（cytochrome bd-type menaquinol oxidase，CytBD）突变株Mtb cydC：aph以及回补株Mtb cydC：aph-Comp暴露在GYY4137中，采用Oroboros O2k呼吸计进行检测，发现当呼吸作用仅由aa3型细胞色素c氧化酶维持时，Mtb cydC：aph中OCR和生长显著下降，这表明H2S在Mtb中主要通过CytBD发挥呼吸和生长促进作用。
在暴露于亚硫酸铜后，Mtb重组代谢和转录机制，包括铜调节子，以减轻亚硫酸铜产物的形成。这表明除了一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）和低浓度O2之外，该研究发现了第四种气体H2S可以诱导Dos休眠调节子。
GYY4137处理的Mtb与未处理相比，更快地被抗结核药甲硝唑杀灭（甲硝唑选择性杀灭缺氧环境中的Mtb）。同时，H2S暴露后呼吸增加导致Mtb细胞中ROS生成增加。以上数据表明，H2S在Mtb进入低氧环境时起到了有益的作用，并保护其免受氧化损伤。
研究观察到与WT相比，Mtb感染8周后的Cbs+/-小鼠肺部iNOS水平升高，体外Mtb暴露于NO后基础OCR及ATP水平都降低，但继续加入GYY4137后可重新提高其OCR及ATP水平。而GYY4137处理的Mtb生存率升高，在加入NO后生存率下降。以上数据表明H2S逆转了NO对Mtb呼吸和生长的抑菌作用。
采用CBS抑制剂氨基氧乙酸（aminooxyacetic acid，AOAA）处理WT小鼠或Cbs+/-小鼠外周血巨噬细胞、加入GYY4137处理上述细胞，检测Mtb存活率、肺部荷菌量以及血清中硫化物的水平，结果发现AOAA通过减少宿主H2S的产生来调节Mtb的感染。
（4）结论：
该研究发现利用宿主H2S促进自身生存是Mtb致病的重要策略，同时揭示了宿主气体递质和Mtb之间复杂相互作用，并提示可将宿主H2S作为结核病治疗的潜在药理学靶点。
［专家点评］
挥发性物质H2S与NO和CO均是气体递质，是哺乳动物体内一种生物相关的信号分子。内源性H2S具有广泛的病理、生理作用，局部H2S浓度较低时，可能发挥多种细胞保护、抗氧化和抗炎功能；而局部浓度较高时，可能成为细胞毒性、细胞抑制和促氧化剂，对人类和动物大多数器官系统都有深远的影响。在哺乳动物中CBS、CSE和3-MST三种酶催化大部分H2S的生成，近年来的研究发现H2S生成的变化与多种肺部疾病的发病机制有关，H2S参与呼吸道调节气道张力、肺循环、细胞增殖、凋亡、信号传导、纤维化、氧化应激和炎症等过程，但宿主产生的H2S在结核发病机制中的作用尚不清楚。本论文Saini V等通过CBS杂合基因敲除小鼠以及随后Rahman等通过CSE基因敲除小鼠的结核感染模型的研究，首次发现宿主产生的H2S可调控Mtb生长、基因表达、能量代谢及呼吸作用，CBS+/-和CSE-/-小鼠与野生型小鼠相比存活时间延长，结核病变减轻，器官菌落数减少，对Mtb感染抵抗力增强，提示CBS和CSE均可引起有害的宿主反应，从而有助于Mtb的生长和疾病的进展。这些发现证明宿主来源的H2S参与了Mtb的致病作用，不仅丰富了我们对Mtb致病机制的认识，也可能产生新的干预模式，如提示CBS或CSE可能成为结核病宿主靶向治疗的合适靶点，针对H2S产生路径设计抗结核新药可能成为研发新策略。Brancaleone V等和Xu S等的研究均证明以H2S为靶点的治疗策略是可行的。用于治疗类风湿性关节炎的D-青霉胺是二甲基半胱氨酸的异构体，Brancaleone V等研究发现D-青霉胺以吡哆醛-5′-磷酸依赖的方式选择性地抑制CSE，从而抑制H2S的生物合成。因此，未来还需深入研究H2S的基本生物学，阐明宿主来源的H2S是如何在结核病病理、免疫和代谢方面发挥作用、促进Mtb毒力和生长、调节Mtb休眠的，CBS或CSE阻断/抑制后会出现哪些与H2S无关的多效性效应，为未来H2S生成抑制剂（如CSE抑制剂——抗关节炎药物D-青霉胺）在结核病治疗中的应用奠定坚实的实验基础。
点评专家：吴雪琼。