第三节 血小板与结核病的发生
血小板限制吞噬细胞的氧化性爆发并促进原发性进行性肺结核
结核初始感染阶段血小板可以改变对Mtb的免疫力，更多严重的肺部病理伴随着血小板增多和血小板功能状态和形态改变，表明血小板参与结核病的发生。血小板迅速迁移到炎症部位并积聚，引发多种免疫功能，如杀微生物蛋白、细胞因子和趋化因子的释放，提示血小板可能参与免疫细胞的直接相互作用并改变其反应性。2020年9月，德国马克斯·普朗克感染生物学研究所的Anca Dorhoi团队在American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine杂志发表了最新的研究。
（1）目的：
应用肺结核小鼠感染模型分析组织中血小板功能，以期了解血小板对结核病发生的影响。
（2）方法
1）细菌：
生长至对数中期的Mtb H37Rv和H37Rv-GFP菌株、铜绿假单胞菌（PAO-1）和嗜肺军团菌（JR32）。
2）动物和感染：
10~12周龄和性别匹配的129S2、C57BL/6和C3HeB/FeJ小鼠。使用glass-Col吸入暴露系统用低剂量（100CFU）或高剂量（1 000CFU）Mtb感染小鼠。轻度麻醉下，在浓度为4×106CFU和1×106CFU的气管内和鼻内感染小鼠嗜肺乳杆菌。
3）血小板消耗和重建：
小鼠接受每3.5天4μg/g身体重量的消耗抗体（R300）或同种型对照（C301）。光麻醉下经眶静脉注射5×108洗净血小板，进行血小板重组。
4）队列研究和流式细胞术分析：
获得书面知情同意书，经上海市肺科医院伦理审查委员会批准，纳入经临床和放射学诊断为肺结核和痰涂片、培养确诊的结核病患者。血细胞经CD14、CD15、CD41a染色并Accuri C6流式细胞仪分析。
5）小鼠细胞分离和流式细胞术：
从器官和支气管肺泡灌洗制备单细胞悬液。经荧光素标记抗体染色，应用CellROX观察总活性氧（ROS），上机前经4% PFA固定细胞，用FlowJo软件分析。
6）组织学和免疫荧光：
肺部切片用苏木精和伊红Y（H&E）染色，并进行细胞类型、自噬和氧化应激标记。通过金胺-罗丹明染色观察Mtb。使用ProgRes CT5软件获取载玻片并用Cell Profiler软件量化免疫荧光。
7）微阵列和基因富集分析：
在TRIzol中裂解BAL细胞，提取总RNA，进行微阵列并用R version 3.5.1软件进行数据分析。
8）统计学分析：
应用GraphPad Prism 7软件，原始或对数转换数据正态性检验采用t检验/方差分析。多组间比较采用单向或双向方差分析（ANOVA），两组t检验和生存曲线分析。P<0.05有统计学意义。
（3）结果：
Mtb感染的TB C57BL/6小鼠中，血小板与各种髓细胞形成聚集体，PMNs和AMs百分比增加。血小板在结核病患者感染肺中的增量积累、血小板发生加速和先天免疫细胞-血小板聚集体的形成表明血小板可能影响结核病的预后。
不同品系小鼠血小板消耗试验显示血小板减少并没有改变Mtb的传播。易感的C3HeB/FeJ小鼠在Mtb感染前不久出现血小板衰竭，并持续到感染后的第一周，肺细菌载量保持不变。炎症影响结核的进展，且血小板抑制药物对结核进展无影响。血小板可改变肺结核患者免疫细胞的肺动态。血小板减少时常驻骨髓种群和各种淋巴细胞的数量保持不变；衰竭时大多数细胞亚群的频率显著降低，同时肺细菌负荷降低。结核病进展中，血小板不改变免疫细胞在肺部的募集。
血小板不能通过调节适应性免疫的动力学和模式来促进结核病的进展。在有血小板存在的Mtb单核细胞分化过程中，血小板减少了髓系细胞中脂滴的积累。血小板耗尽启动后不久对BAL细胞进行了全基因转录组学分析，显示ROS途径富集程度最高。血小板减少小鼠的总ROS水平显著升高，活性氧水平的差异与吞噬细胞内Mtb区室化无关；肺切片原位氧化模式增强，巨噬细胞几乎无变化。因此，在肺结核期间，血小板通过限制NADPH依赖的ROS的产生，调节髓系细胞抗分枝杆菌活性，这在结核病中是有害的，它阻碍了肺常驻髓细胞的细胞（主要是AMs和pmn）固有防御机制。
血小板作为结核病进展的新调节因子与导致急性肺损伤的情况不同，它选择性地限制ROS的产生和髓细胞中的抗菌免疫，对肺结核是有害的。肺结核存在区域免疫专门化，包括巨噬细胞亚群、独特的定位和选择。129S2小鼠是结核进展的可靠模型，在血小板动力学方面与活动性结核病患者相似，提示肺结核患者血小板增多、活化及其外渗与炎症高峰相关，可改变肺结核的免疫事件，调节病理生理学反应。在原发性进行性结核期间，血小板的有害作用独立于典型的激活途径。体外实验表明Mtb并不直接激活血小板，而是由持续的免疫应答诱导，无组织特异性，但对肺结核的进展至关重要。
该研究揭示了早期感染小鼠的血小板-骨髓细胞在血液和BAL中聚集，与疾病易感性相关。在结核病中，AMs和pmn对细菌复制的控制受血小板影响。髓系细胞内Mtb复制的增强可能是由于血小板存在时聚集杆菌的吸收，感染细胞内的Mtb区室化在细胞消耗时未改变，细胞毒性无变化，提示血小板调节髓细胞的内在防御武器库。Mtb利用活性氧并清除活性氧，未感染的细胞中也观察到了活性氧的变化，提示血小板可能会在渗出时促进活性氧的减少，有助于杀死细菌。
人pmn中大量的ROS诱导巨噬细胞坏死和随后的Mtb复制，血小板通过改变疾病的耐受性限制ROS，ROS再通过影响信号或代谢改变Mtb复制。血小板调节ROS的具体机制和后续事件，仍需进一步研究。此外，一旦组织病变建立或重新激活，早期结核感染和晚期感染期间髓细胞功能的调节可能不同。
（4）结论：
早期感染小鼠的血小板-骨髓细胞在血液和BAL中聚集，与疾病易感性相关。Mtb利用活性氧并清除活性氧，有助于杀死细菌。人pmn中大量的ROS诱导巨噬细胞坏死和随后的Mtb复制，血小板通过改变疾病的耐受性限制ROS，ROS再通过影响信号或代谢改变Mtb复制。
［专家点评］
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质，在生理止血过程中发挥着重要的功能。早在1955年，意大利学者Avogaro P和Caturelli G就发现血小板水平和功能与慢性肺结核存在着联系。到了1974年，Shanker A等也发现了血小板与肺结核之间类似的关联。后来随着科学技术的不断发展，人们发现在结核病患者中，初始感染阶段血小板可以改变对Mtb的免疫力，更多严重的肺部病理伴随着血小板增多和血小板功能状态和形态改变，表明血小板参与结核病的发生。但是这些研究大多是观察性研究，缺乏对两者联系的深入分析，特别是从机制上来证明或阐明这些现象。
该研究中，Scheuermann L等应用原发性进行性肺结核小鼠模型分析了组织中的血小板功能，发现血小板存在于感染部位，并在实验性结核病期间与不同的髓系亚群形成聚集体。在结核病患者中也检测到这种聚集物。研究者进一步发现血小板不改变左肺细胞动力学和抗分枝杆菌T细胞反应模式，但通过限制肺驻留骨髓细胞中活性氧的产生阻碍了抗菌防御。该研究首次证明了血小板在原发性进展性肺结核中发挥的有害的作用，提示通过调节先天性免疫反应协调肺免疫，可能适合对这种致命疾病进行新的干预。
无独有偶，早在2004年，Khechinashvili GN和Khvitiya NG发现在结核病不同的病程阶段，血小板的结构是动态变化的，特别是α颗粒、致密颗粒之间的比例变化，线粒体和溶酶体的不同紊乱等。两项研究先后从不同的角度对血小板与结核病之间的关系进行了探讨，Khechinashvili GN等从血小板结构变化入手，而Scheuermann L等则从动物模型、细胞和分子层面对两者之间的关系进行了验证。这两项研究殊途同归，为以后的研究奠定了基础。
点评专家：龚文平。