第二节 PCR实验室的构建及资质申请

一、目的

PCR实验室必须建立严格的实验室管理制度、标准操作规程（standard operating procedure，SOP），制定系列质量管理文件等，确保实验室日常运行符合国家卫生健康委员会（以下简称“国家卫健委”）临床检验中心管理的要求，确保检测结果准确、实验室生物安全及长期稳定运行。

二、范围

适用于PCR实验室。

三、内容

PCR实验室又名基因扩增检验实验室。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的靶DNA序列的复制。通过DNA基因溯源分析，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。

四、建设要求

原则上临床PCR实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气和物理空间的直接相通。根据使用扩增仪的功能，区域可适当合并。例如，使用实时荧光PCR仪时，扩增区和扩增产物分析区可合并；使用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪时，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并（图 1-1、图 1-2）。

PCR实验室建设相关法规文件如下。

1.《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。

2.《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。

3.《临床基因扩增检验实验室工作规范》。

4.《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。

5.《 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》（新型冠状病毒核酸检测实验室适用）。

五、实验室构建

（一）体系文件建立

包括项目文件、仪器设备文件（操作SOP）、制度文件、相关表格、生物安全管理手册。

（二）仪器设备、耗材准备

1.试剂准备区

保存试剂和配制扩增试剂。准备两用冰箱（冷藏、冷冻）、掌上离心机、移液器（20μl、200μl、1000μl）、20～300μl排枪（包括相应枪头、移液器架、垃圾桶及加厚黄色垃圾袋）、扩增用PCR 96孔板、0.2ml 8联排管、电脑、计算器、记号笔（黑色、红色）、签字笔、剪刀、文件架、冰箱温湿度登记表、环境温湿度登记表、紫外灯登记表、试剂使用登记表等。

2.标本制备区

样本的接收、拆包、灭活、编号、加样、录入系统、上机提取、核酸加样等。

（1）标本制备区设备：

生物安全柜、核酸提取仪、两用冰箱（冷藏、冷冻）、干式恒温箱、甩板离心机、掌上离心机、高速冷冻离心机（如需要）、移液器（50μl、200μl、1000μl）、排枪（10μl、50μl）、电脑等。

（2）标本制备区配套：

试管架、移液器架、带滤芯的吸头、封板膜、刮板、泡沫板、计时器、文具（计算器、文件架、黑色和红色记号笔、签字笔、大头夹、剪刀）、密封袋大号、加厚黄色垃圾袋、垃圾桶等。

（3）标本制备区记录：

冰箱温湿度登记表、环境温湿度登记表、紫外灯登记表、试剂使用登记表等。

3.扩增分析区

核酸的扩增与分析区。

（1）扩增分析区设备：

PCR扩增仪。

（2）扩增分析区配套：

文件架、记号笔（黑色、红色）、签字笔、大头夹、剪刀、垃圾桶、加厚黄色垃圾袋、密封袋大号等。

（3）扩增分析区记录：

冰箱温湿度登记表、环境温湿度登记表、紫外灯登记表等。

4.产物分析区

核酸扩增后需要进一步处理的，在产物分析区进行。

（1）产物分析区设备：

根据项目的不同放置所需设备，常用设备有电泳仪、凝胶成像系统、水浴箱、电脑等。

（2）产物分析区配套：

垃圾桶、加厚黄色垃圾袋、密封袋大号、记号笔（黑色、红色）、签字笔、文件架等。

（3）产物分析区记录：

各仪器使用维护保养记录、环境温湿度登记表、紫外灯登记表等。

（三）仪器设备验收与校准

需校准设备有扩增仪（厂家）、核酸提取仪、生物安全柜、高速冷冻离心机（如有）、超净工作台、移液器/加样枪、温度计、温湿度计、电子天平、水浴箱等。校准证书见图1-3。

（四）上墙制度（如《实验室生物安全管理规定》）、5S标识（图1-4）

（五）性能验证

1.预实验

随机临床样本、室内质控。

2.性能验证

精密度或重复性（批内、批间）；正确度或符合性（室间质评、检测下限）。

3.申请表填写

按照申请表要求准备相关资料、装订和递交申请资料。

4.可用工具

（1）临床基因诊断实验室技术验收申请表。

（2）《临床基因扩增检验实验室工作规范》。

（3）《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。

（4）《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。

（5）《临床基因诊断实验室技术验收报告》。

六、体系管理

（一）“人”

1.PCR检测干扰因素多，结果分析复杂，要求工作人员具备掌握相关学科知识及应用能力（实验技能、分析能力、沟通能力等）；应具备较扎实的分子生物学专业知识。

2.核酸检测实验室工作人员应取得上级主管部门颁发的上岗培训合格证书，临床PCR检验过程须在具有培训合格证书的技术人员监督指导下完成，检验报告须由具有培训合格证书的技术人员审核签发。

3.工作人员上岗前必须学习PCR实验管理文件及熟知相关要求，并由科室负责人进行核查。

（二）“机”

1.试剂制备区主要仪器

超净工作台、移液工作站、移液器、冰箱、冰柜、防爆柜等。

2.标本制备区主要仪器

生物安全柜、核酸提取仪、离心机、振荡仪、电脑等。

3.扩增区主要仪器

实时荧光定量PCR仪、电脑、空调等。

（三）“料”

主要指实验过程中所需要的耗材，包括扩增试剂、提取试剂、PCR板和封膜、8联管、带滤芯的枪头、医疗垃圾袋、密封袋等。

（四）“法”

1.法律法规文件。

2.实验室体系文件 综合文件、程序文件、质量手册、生物安全手册、仪器SOP。

（五）“环”

1.各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作。

2.适合的温、湿度和气压。

七、资质申请

（一）医疗机构执业许可证申办

依据1994年2月26日中华人民共和国国务院令第149号发布的《医疗机构管理条例》第九条：单位或者个人设置医疗机构，按照国务院的规定应当办理设置医疗机构批准书的，应当经县级以上地方人民政府卫生行政部门审查批准，并取得设置医疗机构批准书。

1.医疗机构执业许可（执业登记）

在各省（区、市）政务服务网办理。

2.申办对象

申请开办医疗机构的企业、机关事业单位、社会团体和其他机构、个人。

3.办理各医疗（个体）《医疗机构执业许可证》条件

（1）符合当地卫生行政部门《医疗机构设置规划》。

（2）符合《医疗机构基本标准》。

（3）具有当地户口。

（4）房屋建筑面积为40m2以上。

（5）取得国家承认的中专以上学历。

（6）取得本省（区、市）医师职称，并在注册的医疗机构从事5年以上同一专业临床工作的人员。

（7）区外职称卫生技术人员，必须取得医师执业证书，方可申请《医疗机构执业许可证》。

（8）现从事的诊疗活动必须与医师职称专业相同（单科）。

（9）注册资金应为1万元以上。

（二）PCR实验室验收申报

拟开展临床PCR技术的单位，向各省（区、市）临床检验中心的相关机构提交申请材料（《医疗机构执业许可证》复印件、医疗机构基本情况、医疗机构对临床基因扩增检验的需求情况、实验室负责人简历表、PCR实验室平面图、拟开展的检验项目、实验室工作人员一览表、相关技术人员资料、实验设备一览表、实验室质量管理程序文件和SOP目录、规章制度、医疗机构临床基因扩增检验实验室自查/审核表、检验报告单模板、其他相关材料等）。

1.审核　相关机构组织专家库专家对所提交申请材料进行初步审核。

2.现场评审　相关机构组织专家对提交申请的实验室进行现场评审。

3.限期整改　实验室针对评审专家提出的问题，在规定时间内进行整改，并写出整改报告。

4.证书发放。

5.复审　已取得合格证书的实验室，5年后应申请复审。

（三）生物安全二级实验室

根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》第二十五条规定：新建、改建或者扩建一级、二级实验室，应当向设区的市级人民政府卫生主管部门或者兽医主管部门备案。设区的市级人民政府卫生主管部门或者兽医主管部门应当每年将备案情况汇总后报省、自治区、直辖市人民政府卫生主管部门或者兽医主管部门。

1.一、二级病原微生物实验室和实验活动备案

在各省（区、市）政务服务网病原微生物实验室信息管理系统进行办理。

2.备案条件

（1）实验室或实验室的设立单位应具有独立法人资格。

（2）实验室或实验室的设立单位应具有相关主管部门批准的开展病原微生物研究、检测、教学或生产的资质。

（3）实验室设施设备条件应满足GB 19489—2008《实验室 生物安全通用要求》及《广东省卫生厅关于一、二级病原微生物实验室生物安全的管理规定》的要求。

3.受理条件

申请材料齐全且符合《广东省卫生厅关于一、二级病原微生物实验室生物安全的管理规定》的要求。符合一、二级病原微生物实验室备案条件和/或第一、二类病原微生物的实验活动项目开展备案条件。

4.实验室备案登记评估

由申请实验室管理专家根据国家相关法律法规要求以及生物安全防护原则协助实验室对其生物安全进行评估，确认实验室级别以及是否能达到一、二级生物安全实验室基本要求。

5.申请

由申请实验室起草《病原微生物安全实验室资质备案材料》，向相关卫生行政许可部门提出备案申请。

6.受理

（1）受理审核：

相关部门依据申请材料形式标准和申请材料目录，对所提交的申请材料的准确性和完整性进行审查。

（2）材料补正：

若所提交的申请材料不齐全或相关卫生行政许可部门提出特别审查要求的，由申请实验室补正材料。

（3）受理决定：

申请材料符合受理条件的，予以受理，申请不被受理的，出具不予受理决定书并送达。

7.审核

相关卫生行政许可部门对备案材料进行书面审核，如符合规定要求，立即组织相关专家对实验室现场进行审查，并提出审核意见。

（1）经审核全部符合备案条件的，作出符合的结论。

（2）对有部分或全部不符合备案条件的，作出不符合的结论，同时提出具体理由，并将审核结论告知实验室，申请实验室管理专家协助或指导实验室对不符合规定的内容进行整改，并协助在40个工作日内递交补正或修改材料。