第二章　病原真菌的分类命名与鉴定原则

真菌的分类经历了从大体形态到镜下微观形态、从进化论时期到细胞遗传学时期和现代的分子系统学时期。随着现代生物学分类技术的进步，人们对真菌的认识不断加深，从最初的简单宏观形态描述，经过细胞形态观察、遗传性状和生理性状的研究，发展到当今对超微结构、遗传变异、基因序列分析等方面的全面深入研究。病原真菌的分类命名也发生了巨大变化，对病原真菌的正确分类和鉴定需要临床实验室工作者具备广泛的医学真菌分类知识和技能。分子系统学和超微结构的研究为真菌分类带来了很多质的变化。

一、真菌的分类原则

传统的真菌分类学方法主要是基于其形态学特征将真菌鉴定到种水平。但是由于很多真菌存在多种形态，不能单纯依靠形态学进行分类鉴定，需要考虑到真菌的各种特征。在真菌的分类中逐渐引入了生理和生化特性及生态学习性的比较，也从生物学角度考虑到真菌的有性生殖特性，这种分类体系综合了形态学、细胞壁成分、超微结构、细胞学等特性对真菌进行综合分类。真正给真菌分类带来革命性变化的是DNA测序技术的出现，分子水平的分析对真菌的分类和命名产生了重大影响。真菌的分类发生了根本性的改变，其中包括许多重要的病原真菌。现代的真菌学分类引入了种系发生概念，即结合分子生物学技术，主要是核苷酸DNA的序列分析来分类种间、种内及其上下的各种分类群，即真菌的分子系统发育分析。

真菌种的概念随着分类学的进步而不断更新，经典的形态种概念以形态特征为基础，以真菌之间的相似性对其进行分类，以特征的不连续性来区分不同类群。生物种的概念侧重于真菌的有性特征，把种定义为自然居群或个体居群能互相进行交配，并在生殖上与其他居群隔离开来。已在有性的担子菌门、子囊菌门及毛霉目中应用。现代系统发育种概念对种的定义是指经过系统发育分析而确定具有系谱关系的个体群，一个物种的定义是指在多个基因谱系（指不同遗传位点的DNA序列）中具有一致性的一群微生物。目前广泛应用于真菌分类中的基因和基因片段仍然是核糖体RNA编码基因（ribosomal RNA gene，rDNA）的保守区域，特别是核糖体DNA的两个内部转录间隔区（ITS）。

真菌传统分类是以分级的方式排列，真菌界（Kingdom Fungi）下面各级包括门（Division，Phylum）、亚门（Subdivision，Subphylum）、纲（Classis，Class）、目（Ordo，Order）、科（Familia，Family）、属（Genus）及种（Species）。目前分子系统学的分析表明，在较高级别的分类是不稳定的，因为尚难以确定划分界限的“金标准”。目前真菌界普遍接受的分类现状是7个门、10个亚门、35个纲和129个目。这七个门是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、芽枝霉门（Blastocladiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、微孢子菌门（Microsporidia）和新丽鞭毛菌门（Neocallimastigomycota）。接合菌门中的生物被分为球囊球门和四个分类位置未定的亚门。其中医学上意义重要的有毛霉亚门（Mucoromycotina）和虫霉亚门（Entomophthoromycotina），近期虫霉亚门升为虫霉门。

除了真正的真菌以外，还有一些被称为“副真菌”（parafungi）或“假真菌”（pseudofungi）的微生物，如腐霉（Pythium）和链壶菌（Lagenidium）属于原生生物，被分在藻菌界（Kingdom Straminopila或Kingdom Chromista）中的卵菌门（Phylum Oomycota）。但它们具有真菌样的形态学特征，类似丝状真菌（filamentous fungi）。鼻孢子菌（Rhinosporidium）体外培养未能成功，其确切分类尚未确定。

分子系统发生分析的结果除了合并一些原来不同的种以外，还发现一些可能是独立新的种群。它们只能通过DNA测序才能够区分，称为隐蔽的种（cryptic species）。例如，烟曲霉（Aspergillus fumigatus）Section（组）中有40多个隐蔽种，但这样区分新种是否具有临床意义还存在争议。但其中一些隐蔽种对唑类和棘白菌素类（echinocandin）抗真菌药物的敏感性低。

过去将无性阶段的真菌划分在一个人为创建的“半知菌门”中，根据无性繁殖结构的形态特征将其人为划分为不同的纲。随着分子系统学分析技术的应用，对于不产生有性阶段的真菌也能进行分类，找到其相应归属的有性型，因此半知菌这一名称早已不再使用。

二、常见病原真菌的分类

与临床相关的病原真菌主要有3类，即皮肤癣菌、双相真菌和机会性致病菌。致病菌分类以子囊菌最为多见，其次为担子菌和毛霉类真菌。此外，卵菌和丝壶菌中也有某些类真菌致病菌，如疫霉（Phytophthora）和腐霉（Pythium）。下面分述这几类致病菌在现代真菌学中的分类。

（一）子囊菌门（Ascomycota）

子囊菌门包括50%的已知真菌，80%的致病和条件致病性真菌属于子囊菌。有三个亚门含有病原真菌：子囊菌亚门（Pezizomycotina）、酵母菌亚门（Saccharomycotina）和外囊菌亚门（Taphrinomycotina）。

1.外囊菌亚门　只有一个肺孢子菌属（Pneumocystis）有病原性，它以前被归于原生动物界，现在经rDNA基因序列比较后归为真菌。

2.酵母菌亚门　包含一个医学上很重要的纲，即酵母菌纲（Saccharomycetes）、酵母菌目（Saccharomycetales）。该目具有10个不同的属，其中许多成员的无性阶段属于念珠菌属。还有毕赤酵母属、德巴利属中的种能够致病。此外，还包括头状腐生酵母（曾用名：头状地霉）、酿酒酵母、裂殖酵母等。

3.子囊菌亚门　包含两个医学上重要的纲，散囊菌纲（Eurotiomycetes）和粪壳菌纲（Sordariomycetes）。散囊菌纲含有7个目，最为重要的是爪甲团囊菌目（Onygenales），包括皮肤癣菌和双相真菌（如球孢子菌属、组织胞浆菌属、芽生菌属、副球孢子菌属等）的有性型。散囊菌目（Eurotiales）包括曲霉属（Aspergillus）及青霉属（Penicillium）的有性型。粪壳菌纲的肉座菌目包含镰刀菌属（Fusarium）的有性型。致病性暗色真菌（melanized fungi）主要包括枝孢瓶霉属、瓶霉、外瓶霉、凸脐孢、弯孢、链格孢、威尼克何德霉等。它们的有性型也属于散囊菌纲和粪壳菌纲，分别归于煤炱目（Capnodiales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、小囊菌目（Microascales）、格孢腔目（Pleosporales）、肉座菌目（Hypocreales）和长喙壳目（Ophiostomatales）。

（二）担子菌门（Basidiomycota）

担子菌门中有3个亚门：伞菌亚门（Agaricomycotina）、柄锈菌亚门（Pucciniomycotina）和黑粉菌亚门（Ustilagomycotina）及15个纲，但仅有少数为病原真菌。主要有隐球菌属（Cryptococcus），属于伞菌亚门、银耳纲（Tremellomycetes）、银耳目（Tremellales）、隐球酵母科（Cryptococcaceae）和线状黑粉菌目（Filobasidiales）、线状黑粉菌科（Filobasidiaceae）（有性期）；马拉色菌属（Malassezia）属于黑粉菌亚门，马拉色菌纲（Malasseziomycetes），马拉色菌目（Malasseziales），马拉色菌科（Malasseziaceae）；毛孢子菌属（Trichosporon）属于银耳纲（Tremellomycetes），毛孢子菌目（Trichosporonales），毛孢子菌科（Trichosporonaceae）。红酵母属柄锈菌亚门、微球黑粉菌纲（Microbotryomycetes）、锁掷酵母目（Sporidiobolales）、锁掷酵母科（Sporidiobolaceae）。致病性丝状担子菌普通裂褶菌（Schizophyllum commune），也属于伞菌亚门。

（三）毛霉亚门和虫霉门（Mucoromycotina and Entomophthoromycota）

毛霉亚门和虫霉门即原接合菌门（formerly Phylum Zygomycota），传统的接合菌门已经划分为球囊菌门和4个有待进一步分类的亚门，具有致病性的主要为毛霉亚门和虫霉门。毛霉亚门包含毛霉目（Mucorales），主要包括根霉属（Rhizopus）、毛霉属（Mucor）、根毛霉属（Rhizomucor）、横梗霉属（Lichtheimia）（原名犁头霉属，Absidia）、小克银汉霉属（Cunninghamella）、共头霉属（Syncephalastrum）、科克霉属（Cokeromyces）、壶霉属（Saksenaea）、囊托霉属（Apophysomyces）、厚垣孢犁头霉属（Chlamydoabsidia）等，是毛霉病的主要病原体。虫霉门包含虫霉目（Entomophthorales），其中蛙粪霉属（Basidiobolus）和耳霉属（Conidiobolus）是引起皮下感染的主要病原体。

（四）微孢子虫门

过去一些专门寄生于人类的微孢子虫一直被归类为原生动物。经过系统进化分析表明它们属于真菌，因此在真菌界为其设立了微孢子虫门（Microsporidia），这是一类由孢子形成的单细胞性胞内寄生菌，临床常见的脑微孢子虫主要引起艾滋病及免疫抑制患者的肠道感染。

三、真菌的命名原则

真菌的命名原则一直遵循瑞典植物学家林奈在1753年创立的“双名制命名法”，即属名+种名+命名人。后来在此基础上，国际命名法规（Internationnal Code of Nomenclature，ICN）对于真菌命名做了详细规定，采用林奈的拉丁双名法，一个真菌只能有一个属名和种名。按照此法规，命名新的真菌必须遵循ICN的命名规则，否则将被视为无效。完整的真菌名称应以拉丁语双名制的形式命名并提供命名人，应附有英文或拉丁文的描述，命名人所描述的真菌，其活的培养物应储存在公认的菌种库中。新的名称应在以下3个在线分类数据库之一进行注册，MycoBank、Index Fungorum或Fungal Names，并获得一个注册编号。简述真菌的命名原则如下：

（一）术语及分类群名称

真菌的分类单位与其他生物相同，属以上的单位都有固定词尾。界（Kingdom，Regnum）；门（Division，Phylum），词尾（-mycota，-phyta）；亚门（Subdivision，Subphylum），词尾（-mycotina，-phytina，）；纲（Classis，Class），词尾（-mycetes，-opsida）；目（Ordo，Order），词尾（-ales）；科（Familia，Family），词尾（-aceae）。属（Genus）名是拉丁语的单数名词；种（Species）名是属名和一个单词的种加词的双名组合，为形容词，与属的性、数、格一致。

（二）合格名称

要符合法规各项规定，否则称不合格名称，或称异名、同名、重词名等。

（三）优先律

菌种命名选用发表最早的正确、合法的名称。以犬小孢子菌为例，最先由Bodin发表（Microsporum canis Bodin 1902），后来Sabouraud改变其名称，称羊毛小孢子菌[Microsporum lanosum（Bodin）Sabouraud 1907]。但根据优先律，承认犬小孢子菌为正确名称，而羊毛小孢子菌为异名。

（四）转属规则

转属规则为转属不转种。如絮状表皮癣菌原名为絮状单端孢，Trichothecium floccosum Harz 1870。以后转属为表皮癣菌，但仍保留种名，如Epidermophyton floccosum（Harz）Langeron et Milochevitch 1930。要将原命名人用括号括起放在转属命名人的前面。

（五）对种属名称的要求

属名可来源于任何语言，但应按拉丁文处理。种的名称也可来源于任何语言，甚至人名、国名等。属名第一个拉丁文字母要大写，其他为小写。属名和种名在印刷体中要用斜体字，手写体在字母下加横线，后缀命名人的姓氏和出版年代，命名人用正体。

（六）目前在真菌命名中存在的主要问题

很多病原真菌的名称可能会面临名称的变更。其原因在于，过去对真菌产生无性型和有性型的情况并不清楚，多次被不同研究人员描述为新种，分别对其无性阶段和有性阶段进行命名。因而很多常见的真菌具有多个名字，而随着现代分类学进展确定其应归属于其有性型，合并为一个种或者重新划分为新种，这样就使真菌的分类命名面临很多问题。在2011年在墨尔本召开的第18届国际植物学大会上确立了“一个真菌一个名称”的理念。建议逐渐取消同时使用真菌的无性与有性两个名称，对于已有的存在多个名称的真菌，将依据优先权的原则来处置。真菌学家们开始为许多真菌物种从现有的几个名字中选择一个名字。规定同一种真菌的所有有性或无性名称，均可以作为该菌的唯一名称。详情请参见国际真菌分类命名委员会（ICTF）网站。

一般情况下，任何一个物种的正确名称都应是最早发表的符合命名法规的那个名称。后来的名称被称为异名。为了避免出现困惑，ICN也允许一些例外，如果某个真菌的新名称已经普遍使用，再改用早期的名称会引起混乱的情况，特别是也会牵涉到临床所致疾病的命名时，可以考虑继续使用普遍采纳的名称。如果将“隐球菌病”改用其有性型命名的“线状黑粉菌病”将会引起很多问题，故依然沿用原来的名称。目前在医学真菌学领域专家们比较一致的共识是，如果没有重要临床意义，不影响抗真菌治疗的效果，可以暂时沿用以往的真菌名称，或者采用包容性比较强的复合体（complex）这一名称来代表可能涵盖很多隐藏种的真菌种群，如近平滑念珠菌复合体（Candida parapsilosis complex）。在曲霉中多采用Section（组），如烟曲霉组（Aspergillus fumigatus section）。

其他详细的真菌命名规则可参考有关文献。

四、病原真菌的鉴定原则

病原真菌的鉴定不仅是临床的需要，在植物病理学、生物进化、生物技术和环境的研究中都很重要。许多真菌已经鉴定到种，但是分类学家仍致力于新种的描述和其分类群的研究。有些菌种由于经济学的关系或是病理学的重要性，已有深入的研究，其他则需要现代手段来进行研究。分子生物学和质谱等现代方法和技术的应对病原真菌的鉴定发挥了促进作用，但在临床真菌检测实验室中，对于一个真菌培养物，首先要区分酵母菌与霉菌这两大基本类别。然后选用相应的形态学、生理生化及分子学等手段进行精确的鉴定。

（一）形态学鉴定

形态学鉴定：用表型特征来进行分类鉴定是过去和现在实验室依然普遍采用的方法。致病真菌的鉴定，一般都需要借助光学显微镜，现在加上荧光染色和细胞化学及各种染色法使观察更加方便。单纯依靠真菌在宿主体内的寄生形态鉴定比较困难，如菌丝只能看到有无分隔，有无色素，往往还需要通过选择合适的培养基进行培养来鉴定菌种。

酵母菌的鉴定需要结合其形态学、生理学和生化特征。形态学特征包括菌落的颜色、大小、细胞的形状、有无荚膜；菌丝、假菌丝（pseudohyphae）和关节孢子（arthroconidia）以及厚壁孢子（chlamydospores）的产生；生化实验包括糖的同化与发酵实验和硝酸盐同化实验。具有医学意义的大部分酵母可以应用一个基于分离菌株的糖同化实验的商品化检测系统进行鉴定。此外，用显微镜检查玉米粉吐温琼脂培养基上的形态也是必要的。在许多实验室，生化方法已被DNA测序或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法所取代（MALDI-TOF MS），详见第八章。

形态学鉴定目前最适用的还是无性霉菌，由于从临床实验室分离出来的大部分霉菌在常规培养基上并不产生有性生殖结构，对它们的鉴定主要是基于其无性孢子的产生方式，还可通过基因测序的方法来确定它们在真菌界中的正确位置。基于这类霉菌其分生孢子的发生，把它们分为两类，即产生分生孢子梗和产生分生孢子器的类型，在菌丝或特定的分生孢子梗上产生分生孢子，或者有精细的被称为载孢体（conidioma）的无性生殖结构。这些形式提供了基于形态学鉴定的准则。

产生分生孢子器的类群中包括一些菌属是人类常见病原体，如新双间柱顶孢菌（Neoscytalidium dimidiatum）可导致皮肤和指甲感染。

产生分生孢子梗的类群中包含大量的医学上非常重要的霉菌，例如，曲霉属（Aspergillus）、芽生菌属（Blastomyces）、枝孢瓶霉属（Cladophialophora）、镰刀菌属（Fusarium）、组织胞浆菌属（Histoplasma）、小孢子菌属（Microsporum）、青霉属（Penicillium）、瓶霉属（Phialophora）、赛多孢霉属（Scedosporium）和毛癣菌属（Trichophyton）。此外，大量的丝状真菌是人类的条件性病原体。在鉴定这些霉菌时，分生孢子的产生过程是主要的依据。

除此之外，用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）来观察菌的断面可发现子囊菌酵母和担子菌酵母的横隔不同；扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）在实际应用有许多发现，如根据子囊菌的表面结构可以鉴定到种。有助于观察孢子发生方式，如环痕等。

现代形态学技术，如采用自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学来分析形态学的特点。由于表型各种词语没有一定的标准，有很大的主观性，某些表型特征也不稳定，受环境影响，有的不能在人工培养基上生长，有一些真菌尚未分类，因此，分类地位有待进一步确立。

（二）分子生物学鉴定（molecular identification）

鉴于表型分类的局限性，在分类学上遗留不少问题和争议。分子生物学鉴定：应用分子生物学技术从遗传和进化角度阐明真菌菌种之间和种间内在关系是目前真菌分类研究的热点，已普遍应用于真菌现代分类鉴定之中。

常用的分子生物学鉴定方法包括：真菌DNA碱基组成（G+C Mol%）、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、Southern印记、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）、rDNA序列测定等。由于生物多样性的缘故，分子生物学的研究有4种目的：①系统发生研究；②分类学研究，主要在属、种水平；③鉴定应用，即决定明确的分类名称；④流行病学和群体的遗传学研究。

DNA序列测定是目前最引人注目的发展方向，已成为致病真菌的分类鉴别的重要手段。目前应用最多的为核糖体DNA（rDNA）的不同基因和片段，如：18S和28S rDNA基因（SSU和LSU）、内部转录间隔区（ITS），翻译延长因子（TEF-1α）、β-微管蛋白（β-tubulin）、钙调蛋白基因（CAL）、肌动蛋白（ACT）、甲壳质合成酶（CHS）、RNA聚合酶Ⅱ大亚基（RPB2）等基因序列，是常规鉴定方法的重要补充，越来越接近真菌自然分类的目的，详见第六章。

DNA芯片技术是用免疫荧光标记的待测样品与有规律地固定在芯片片基上的大量探针按碱基配对原则进行杂交，通过激光共聚焦荧光系统对芯片进行扫描，使用计算机进行荧光信号强度的比较和检测的技术。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。将不同属种真菌的特异性DNA标记后制成DNA芯片，将致病真菌DNA与DNA芯片杂交就可得到属种特异性图谱，通过这种图谱的比较和分析，就可得出致病菌的DNA信息，进而可对其进行鉴定。

（三）其他鉴定方法

其他鉴定方法：包括生理学和生物化学、次级代谢产物、泛醌系统、脂肪酸组成、细胞壁组成及蛋白质组成。

1.生理学和生物化学

在纯培养上真菌生长比较快，可以使用生理、生化方法来鉴定菌种，如黑酵母的鉴定。在一定的培养基上，有对照，其生长速度也可用于鉴定，如青霉。温度实验测定真菌的不同生长温度也用于鉴定。对碳水化合物的利用能力是酵母菌鉴定的主要手段，目前已有商品化的API系统，也可用于丝状真菌的辅助鉴定。

2.次级代谢产物

次级代谢产物既不是为了生长需要，也不是介导基本代谢，常常为混合物，有特殊的和极罕见的化学结构。常见的是固醇、萜、类碱、香豆素等，某些是真菌毒素。将小量从培养皿切下来的标本，直接进行层析色谱法检查，比传统浓缩抽取提纯法简单易行。此法用于地衣的鉴定较好，很少用于真菌分类，由于对环境有一定影响，而且比较难，较少应用，但有人应用于子囊菌的分类。

3.泛醌系统

是一种初级代谢产物，起重要作用。泛醌即辅酶Q，是呼吸系统电子传播链的携带者。一些异戊二烯（isoprene）接触醌核各有不同，对鉴定到属或属以下水平很有帮助。主要用于鉴定细菌和酵母，也用于黑酵母和丝状真菌。

4.脂肪酸组成

此法在细菌学方面是常规应用的，一是测定其成分，二是测相对浓度，极少用于真菌分类。主要应用裂解气相色谱法、热解块状光谱仪、气相色谱仪、隔膜水相聚合物双相系统等。近来应用气相色谱法合并多变量统计分析方法，成功地用于丝状真菌，包括卵菌、担子菌、毛霉，甚至只有菌丝的真菌。用于种间水平的鉴定。应注意影响因素，如培养状态和温度等。

5.细胞壁组成

子囊菌和担子菌含有甲壳质和葡聚糖，毛霉类真菌含有脱乙酰甲壳质（chitosen）和葡聚糖醛酸。不同的皮肤癣菌的细胞壁含有不同的糖分，酵母细胞壁或缺乏或含有少量其他多糖（如岩藻糖、乳糖、鼠李糖、木糖等）。

6.蛋白质组成

用电泳方法分析同工酶，可将真菌鉴定到属或种。电泳、免疫学方法、蛋白质分析等可解决种间特性。同工酶分析是一个经济和实用的技术。等位基因酶（allozyme）通常用于系统发生的研究。目前采用电离飞行时间质谱技术来鉴定病原真菌，也是一种准确、省时、高效的手段。

（李若瑜）

主要参考文献

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