第一节 结核病易感性

白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）介导Ⅰ型干扰素驱动的结核分枝杆菌易感性。

人类感染Mtb会导致无症状的肺部肉芽肿，也可以发展为致命性的播散性疾病。目前还没有可靠的疫苗可以预防肺结核。最近的研究表明，增强的Ⅰ型干扰素能在确诊前18个月就预测发展成为活动性结核病。此外，Ⅰ型干扰素受体（typeⅠIFN receptor，IFNAR1）的部分功能丧失与耐药结核病相关。

由于缺乏合适的小鼠模型，对干扰素是否或如何介导对Mtb的易感性的研究一直很难开展。2020年10月，加拿大麦吉尔大学的Maziar Divangahi研究团队在Cell杂志发表了最新的研究成果。该研究检测了携带易感等位基因sst1位点的B6.Sst1s同源基因小鼠，该基因对Mtb具有易感性。研究发现B6.Sst1s对Mtb的易感性与Ⅰ型干扰素的表达增强有关。而且，仅编码IL-1Ra的单个干扰素靶基因il1rn的杂合子缺失，就足以逆转B6.Sst1s小鼠对Mtb干扰素驱动的易感性。此外，抗体介导的ILl-1Ra中和作用对Mtb感染的B6.Sst1s小鼠具有治疗作用。研究结果表明B6.Sst1s小鼠在模拟干扰素驱动的Mtb易感性方面的价值，并证明IL-1Ra是体内由Ⅰ型干扰素驱动的Mtb易感性的重要调节因子。

（1）目的：

本研究检测了携带易感等位基因sst1位点的B6.Sst1s同源基因小鼠，该基因对Mtb具有易感性。

（2）方法

1）小鼠：

B6.Sst1s、Stinggt/gt等小鼠都无特定病原体。在每个实验中，所有基因型的小鼠在开始感染时都在6~10周龄。小鼠实验不采用随机化或数据盲法。

2）Mtb感染：

所有感染均使用Mtb Erdman菌株，在7H9液体培养基中37℃培养。小鼠用吸入暴露系统进行气溶胶感染。感染后测量菌落形成单位（colony forming unit，CFU）和/或细胞因子，同时做病理学检查和提取RNA。

3）细胞因子测量：

分离肺并取一部分匀浆液涂板用于测量CFU，除白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和IL-1Ra外，所有细胞因子均采用细胞珠法进行检测。采用小鼠IL-10 ELISA Ready-Set-Go测定IL-10水平。采用小鼠IL-1Ra/IL-1F3定量ELISA试剂盒测定IL-1Ra水平。

4）IL-1生物活性检测：

用感染低剂量Mtb的小鼠来制备无细胞肺匀浆。样品用HEKBlue IL-1R细胞检测。

5）流式细胞术：

分离肺组织，用BD Fortessa X-20型流式细胞仪采集数据，用FlowJo V10软件进行分析。

6）骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophages，BMMS）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）治疗：

采集小鼠股骨和胫骨的骨髓，在非组织培养平板上进行细胞分化，培养6天后收集骨髓基质细胞。

7）定量RT-PCR：

肺组织提取RNA，制备互补DNA。使用QuantStudio 5实时PCR系统和Power SYBR Green PCR Master Mix进行定量PCR检测。

8）抗体介导的中和：

所有治疗均通过腹腔注射进行。细胞室培养基采用超低免疫球蛋白血清，以减少纯化过程中牛免疫球蛋白的污染。

9）统计分析：

所有生存资料用双侧log-rank检验进行分析。除非另有说明，所有其他数据均采用双侧Mann-Whitney U检验进行分析。

（3）结果：

本研究采用的小鼠品系是B6.Sstls，来自该小鼠的骨髓巨噬细胞表现出增强的Ⅰ型干扰素反应。与B6相比，感染B6.Sst1s的肺显示出更高水平的Ifnb转录本。用IFNAR1阻断抗体来抑制Ⅰ型干扰素信号后，细菌负荷显著降低。同时发现，Ifnar缺乏在很大程度上逆转了B6.Sst1s小鼠对Mtb感染的易感性。有数据表明，干扰素诱导Mtb感染需要宿主的STING蛋白。然而，与B6.Sst1s小鼠相比，将B6.Sst1s小鼠杂交到干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）缺陷的Stinggt/gt小鼠，并未显著降低细菌负荷，B6.Sst1sStinggt/gt小鼠的存活率也并未提升。因此，Sst1s位点直接或间接地作用于增强体内Ⅰ型干扰素信号，从而加重Mtb感染，特别是在感染的早期阶段。

B6和B6.Sst1s小鼠在Mtb感染期间肺组织中IL-10和γ干扰素水平没有显著差异。此外，B6.Sst1s小鼠在感染后25天的肺组织中IL-1α和IL-1β的水平高于B6小鼠。

B6.Sst1s小鼠用IL-1R1封闭抗体处理后，与同类型对照抗体处理的小鼠相比，细菌负荷增加，说明IL-1对B6小鼠具有保护作用。但是，B6.Sst1s小鼠体内高水平的IL-1蛋白不足以抵抗感染。

为了评估感染小鼠肺中功能IL-1信号的水平，该研究采用了IL-1报告生物测定法来检测游离肺的无细胞培养上清液中IL-1的活性。感染B6.Sst1S小鼠的肺似乎具有较低的功能IL-1信号能力，而B6.Sst1sIfnar-/-小鼠的IL-1信号水平则相反。

该研究进一步从遗传学角度分析在Mtb感染过程中，过量的Ⅰ型干扰素信号是否中和了B6.Sst1s小鼠通过IL-1Ra介导的IL-1信号，结果显示杂合子和纯合子IL1rn缺乏症都能保护B6.Sst1s小鼠免受结核分枝杆菌感染。感染肺的组织学样本显示，与B6.Sst1s相比，B6.Sst1sil1rn+/-和B6.Sst1sil1rn-/-小鼠的病变面积均显著减小。

IL-1Ra部分降低对B6Sst1s小鼠有明显的保护作用，提示IL-1Ra可能是Mtb感染过程中宿主导向治疗的合适靶点。用抗IL-1Ra抗体治疗感染的B6.Sst1s小鼠后，接受抗体的Sst1s小鼠的肺部细菌负荷显著降低，肺部病变减少。为了确定IL-1Ra是否作用于Ⅰ型干扰素信号的下游，他们中和了B6.Sst1sIfnar-/-小鼠的IL-1Ra。抗IL-1Ra抗体处理后B6.Sst1sil1rn-/-小鼠的细菌负荷与对照组相似，与B6.Sst1sIfnar-/-小鼠IL-1Ra的低表达一致，而抗体处理后B6.Sst1s小鼠的菌落数量减少。

Sst1基因长约10Mb，编码约50个基因。该研究表明，在B6（Sst1R）小鼠中，Sst1基因位点直接或间接地抑制Ⅰ型干扰素信号。以前发现Sst1s小鼠缺乏Ipr1（也称为Sp110）的表达，B6来源的Ipr1/Sp110的重新表达部分恢复了小鼠对Mtb的抗性。因此，Ipr1/Sp110的缺失可能是Sst1s表型的原因，尽管这一点还有待于B6.Ipr1-/-小鼠的传代确认。人类Sp110基因多态性与某些队列中的结核病相关。Ipr1/Sp110是Sp100转录调控家族的成员，它能调节Ⅰ型IFN和/或干扰素诱导基因的染色质状态。

人们对开发针对Mtb的宿主导向疗法的兴趣与日俱增。如果Ⅰ型干扰素确实加剧了人类的结核病，那么以IL-1Ra为靶点的宿主导向疗法前景可期。

（4）结论：

B6.Sst1s小鼠可以作为研究干扰素驱动的Mtb易感性的动物模型，而且IL-1Ra是体内由Ⅰ型干扰素驱动的对Mtb易感性的重要调节因子。

［专家点评］

干扰素（interferon，IFN）可分为三个家族：Ⅰ型IFN包括IFN-α与IFN-β，IFN-α是由群聚在第9对染色体上的至少23个不同基因编码的多种功能蛋白，而IFN-β只由单个基因编码，主要由固有免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、白细胞）和成纤维细胞等分泌，结合相同的受体，该受体是由IFNR1和IFNR2两个亚基组成的位于细胞膜上的异源二聚体；Ⅱ型IFN即IFN-γ，主要由活化的T细胞产生，发挥主要的抗结核作用；Ⅲ型IFN为IFN-λ，目前对其了解有限。Ⅰ型干扰素是参与抗病毒免疫的重要效应分子，在2020年研究发现Ⅰ型IFN在抗细菌、病毒及抗真菌感染中既有一些正效应、也有一些负效应，如一些研究发现Ⅰ型IFN能够促进树突状细胞、CD4+与CD8+T细胞及B细胞的活化；而Lee JS等的研究发现重症新型冠状病毒肺炎患者的单核细胞中，Ⅰ型IFN应答与TNF/IL-1β驱动的炎症同时存在，Ⅰ型IFN加剧了重症患者的炎症；目前的研究也发现增强型Ⅰ型IFN反应与活动性结核病进展及Mtb感染的易感性相关，Mtb强毒株能够诱导更高水平的IFN-β。

为了阐明Ⅰ型IFN介导活动性结核易感性的机制，本论文Ji DX等在B6基因背景上携带一个C3HeB/FeJ小鼠1号染色体上10.7Mb的“对结核病超易感性1”区域，创新地建立了B6.Sst1s小鼠IFN驱动的结核易感性模型；通过一系列研究证明了体内Ⅰ型IFN信号增强，会加重Mtb感染，尤其是在感染的早期阶段。Ⅰ型IFN可诱导数百个靶基因的表达，IL-1α和IL-1β均是促炎性免疫反应的主要诱导因子，IL-1Ra是IL-1生物活性的竞争性抑制剂。Ⅰ型IFN可通过多种机制负性调节抗Mtb免疫反应，Ji DX等研究发现Mtb感染期间IL-1Ra的编码基因il1rn显著上调，诱导表达的IL-1Ra与IL-1R1和IL-1R2结合后无信号传导，却竞争性阻断IL-1α/β的结合，使体内高水平的IL-1α/β不能抵御Mtb感染。因此，由单核/巨噬细胞产生的IL-1Ra是体内Ⅰ型IFN驱动的Mtb易感性的重要介导因子。Ji DX等通过抗IL-1Ra抗体治疗Mtb感染的B6.Sst1s小鼠，以阻断IL-1Ra、恢复IL-1与IL-1R1的结合，使小鼠体重显著增加、肺病变减少及细菌负荷显著降低，证明通过阻断IL-1Ra可降低B6.Sst1s小鼠由Ⅰ型IFN驱动的结核易感性，也提示IL-1Ra可能成为Mtb感染期间宿主导向治疗的靶点。2018年美国食品与药物管理局（FDA）已授予目前唯一吸入给药的IL-1Ra研究性产品OSP-101孤儿药资格认证，用于治疗闭塞性细支气管炎，也证明IL-1Ra靶向治疗的可行性。未来在研究结核病宿主导向治疗时，尤其是对于耐多药或广泛耐药结核病的辅助治疗时，应对Ⅰ型IFN导致Mtb感染中的免疫抑制以及炎症反应、使结核病加重的机制进行进一步深入研究，IL-1Ra或IL-1R的宿主导向治疗可能成为调节肺结核免疫病理细胞因子网络的一种可能途径，但需在动物实验中进一步验证其对结核病的治疗效果。

点评专家：吴雪琼。