第二节 电离辐射在分子与细胞水平的效应
一、靶学说、靶效应与非靶学说
1.靶学说与靶效应
靶学说认为，电离辐射生物效应是由于电离粒子击中了某些分子或细胞内特定靶的结果。其基本含义是细胞至少含有一个靶或遗传关键位点，被电离辐射击中后致使细胞死亡或产生某种损伤效应。在一个生物靶中发生一次电离或有一个电离粒子穿过，产生某种所期望的生物效应，称为单击效应（single-hit effect），这是靶学说中最基本的假说，也是多击效应（multi-hit effect）的基础。而多击效应是2次或2次以上击中生物靶的电离事件而引起的辐射生物效应，其曲线常呈S形。在靶受击开始时，于一个靶体积中产生两个反应的概率很小，生物分子或细胞失活的速率很低。经过一定剂量照射后，那些受到单击而保持活性的分子或细胞，再被击中时，其失活速率急剧上升。
2.非靶学说及其他效应
近年来，电离辐射引起的非靶效应（non-target effect）成为放射生物学研究领域的热点，并逐渐形成了较为完整的非靶学说。经典的靶学说理论认为，辐照诱发DNA损伤发生在受照的当代或第二代，也就是照射后的1～2个细胞周期内。实际上，辐照细胞的存活后代表现出持久性的基因组损伤及其细胞学后果，即基因组不稳定性，与辐射旁效应和低剂量辐射诱导的适应性反应共同构成了非靶学说的生物效应基础。
电离辐射旁效应是指受到辐射作用后，未被射线粒子直接贯穿的邻近细胞表现出损伤效应。未照射细胞（旁细胞）的后代也发生基因组不稳定性，其信号的产生与射线之间不存在显著的剂量效应关系，高传能线密度（linear energy transfer，LET）射线比低LET射线更能诱导旁效应。
电离辐射诱导的适应性反应是指在高剂量电离辐射前给予低剂量辐射，使细胞产生一定的抗辐射性，主要取决于细胞系和细胞模型、实验环境等因素的影响，其机制复杂。
二、DNA的辐射生物效应
DNA是电离辐射作用于生物体的重要靶分子之一，沿电离辐射径迹能量沉积致DNA产生一系列损伤，包括单一位点损伤和区域多位点损伤是电离辐射生物效应的关键原初分子事件。但DNA损伤修复能力的高低也是影响放射敏感性的重要因素。
1.DNA链断裂
电离辐射作用致DNA双螺旋结构中一条链断裂时，称为单链断裂（single strand break，SSB），两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂时，称之为双链断裂（double strand break，DSB）。DNA链断裂可以直接由于脱氧戊糖的破坏或磷酸二酯键的断裂，也可以间接通过碱基的破坏或脱落所致。
2.DNA交联
在DNA双螺旋结构中，一条链上的碱基与其互补链上的碱基以共价键结合，称为DNA链间交联；DNA分子同一条链上的两个碱基相互以共价键结合，称为DNA链内交联，如嘧啶二聚体就是链内交联的典型例子。DNA与蛋白质以共价键结合，称为DNA-蛋白质交联。电离辐射可引起上述各种形式的DNA交联。
3.DNA二级和三级结构的变化
DNA双螺旋结构靠3种力量保持其稳定性，一是互补碱基对之间的氢键，二是碱基芳香环π电子之间相互作用而引起的碱基堆砌力，三是磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键。电离辐射作用时，DNA大分子发生变性和降解。DNA变性系指双螺旋结构解开，氢键断裂，克原子磷消光系数显著升高，出现了增色效应，比旋光性和黏度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变，同时失去生物活性。DNA降解比变性更为剧烈，伴随着多核苷酸链内共价键的断裂，分子量降低。这些都是由于一级结构中糖基和碱基的损伤及二级结构稳定性被破坏的结果。
4.DNA集簇损伤
应用辐射生物物理学和辐射化学理论和方法进一步证实，电离辐射不仅诱导单一的DNA损伤，还可在射线的轨迹方向形成DNA集簇损伤，其损伤复杂，不易修复。不同DNA位点的集簇损伤往往是电离辐射所致生物损伤效应和遗传效应的主要原因，尤其是高LET照射。
三、细胞存活的剂量-效应曲线
为便于了解辐射细胞效应的规律，将研究数据概括为细胞存活的剂量-效应数学模型。最常见的曲线有单击曲线、多击或多靶曲线、双相曲线、刺激曲线，均属于指数模型。指数模型的横坐标代表剂量，纵坐标代表存活分数。指数模型的曲线形式为一条指数曲线。
1.指数“单击”曲线
在指数单击曲线中，细胞（或生物大分子）的存活分数为辐射剂量的简单函数，以半对数作图时呈现一条由高至低的直线。这种情况见于病毒或酶的灭活及少数哺乳动物细胞的杀灭。其方程式如下：
S=e-kD
式中，S为某剂量下细胞的存活分数，D为所受剂量；k为常数，与射线性质及细胞敏感性有关；e为自然对数的底，数值为2.718。若将存活分数取对数，则上式为：
lnS=-kD
纵坐标改为对数坐标，以半对数作图时，lnS与剂量D及k便成直线关系。按照靶学说的解释，上述情况属于单击单靶模型，即在细胞或生物大分子内存在一个敏感的靶区，靶区被辐射击中1次即可引起死亡或灭活，这种曲线称之为单击曲线。
引起细胞（或酶分子）63%死亡（或灭活）的照射剂量称为D37剂量。在此剂量下有37%的细胞（或酶分子）存活。在D=0时，S=e0=1，即100%存活。在D=1/k时，S=e-1=0.37，所以e-1=e-kD37，kD37=1，k=1/D37，D37的倒数即为存活曲线的斜率。
2.“多击”或“多靶”曲线
哺乳动物细胞典型的剂量存活曲线如图2-3。以半对数作图时，纵坐标（对数刻度）为存活分数，横坐标（线性刻度）为剂量。图中剂量存活曲线的起始部分为肩区，当剂量加大时，存活曲线即呈直线。
根据靶学说的解释，这种情况属于多事件曲线，即细胞内必须有一个靶区被击中多次，或是多个靶区各被击中1次才引起效应，前者称为多击单靶模型，后者称为单击多靶模型。
剂量存活曲线的直线部分斜率的倒数为D0值，称为细胞的平均致死剂量（mean lethal dose）。D0愈小，斜率愈大。D0值的大小代表细胞放射敏感性的高低。在剂量存活曲线的直线部分，D0值为使细胞的存活分数由0.1减少至0.037所需要的剂量，或是使细胞的存活分数由0.01减少至0.003 7所需要的剂量。由纵坐标0.1和0.037处各作与横坐标相平行的线与存活曲线直线部分相交，两个相交点在横坐标上投影的两个剂量点之差即为D0值。若将直线部分外推，与纵坐标相交点的数值称为外推n值，图2-3中为3。n值代表细胞内靶的个数或所需击中靶的次数。由纵坐标1.0处（即细胞存活100%）作一条与横坐标的平行线，与外推线的交点在横坐标上投影点的剂量即为Dq值，称为准阈剂量（quasithreshould dose，Dq）。Dq为克服肩区所需的剂量。哺乳动物细胞的D0值多为1～2Gy。n值多为1～3。Dq值通常较小，一般为0.5～2.5Gy。
图2-3 增殖的哺乳动物细胞的剂量存活曲线
哺乳动物细胞的剂量存活曲线多属于“多击或多靶模型”。可由下式表示：
S=ne-kD
式中，S为某剂量下细胞的存活分数，n为外推值，D为照射剂量，k为存活曲线直线部分的斜率，其倒数为D0值。由于Dq代表细胞累积致死性损伤的能力，在此剂量下细胞尚未出现死亡，故S=1，代入上式即得：
S=1=ne-kD
Dq=lnn/k
当D37为引起63%的细胞死亡（37%细胞存活）的剂量时，
D37=D0+Dq
如果存活曲线无肩区，则Dq=0，则D37与D0相等。这就是“单击单靶模型”的情况。也可用另外一种方式获得D0值，即通过存活分数1.0作一条与存活曲线直线部分平行的线，此线与存活率0.37水平线相交点在横坐标上投影点的数值即为D0值。
四、细胞放射损伤及其修复
1.细胞放射损伤的分类
电离辐射引起的哺乳类细胞损伤分为3类。第1类为致死性损伤（lethal damage），为用任何办法都不能使细胞修复的损伤称为致死性损伤，此类损伤不可修复，不可逆地导致细胞死亡。第2类为亚致死性损伤（sublethal damage），照射后经过一段充分时间能完全被细胞修复的损伤称为亚致死性损伤；在正常情况下于几小时之内修复，若在未修复时再给予另一亚致死性损伤（如再次照射），则可形成致死性损伤。第3类为潜在致死性损伤（potentially lethal damage），这是一种受照射后环境条件影响的损伤，在一定条件下损伤可以修复。
2.潜在致死性损伤的修复
潜在致死性损伤是由于细胞所受损伤是致死性的，通常情况下将引起细胞死亡，但其可通过适宜地控制照射后的环境条件而被改变。受潜在致死性损伤的细胞，如改变其所处的环境条件，使细胞在特定剂量照射后的存活分数增高，称为潜在致死性损伤修复（potentially lethal damage repair，PLDR）。
照射后当细胞处于次佳生长条件时，潜在致死性损伤即被修复，细胞存活分数增高。因为次佳生长条件可使有丝分裂延迟，DNA损伤得以修复。目前认为，细胞潜在致死性损伤的修复与DNA双链断裂的修复有关。潜在致死性损伤的修复在临床放射治疗中有重要意义，在动物移植肿瘤中已得到证实。
3.亚致死性损伤的修复
哺乳动物细胞受X射线照射后，其剂量存活曲线的特点是在低剂量部分有肩区。这种反应特点表明，必须积累损伤才能产生致死效应。从靶学说的观点分析，细胞丧失其增殖能力之前，必须有多个靶被损伤（击中），多靶现象可解释存活曲线起始部分的肩区。若细胞群体受到一定剂量照射，群体中的不同细胞可以发生下列3种情况之一：①细胞内没有任何关键靶区被击中，因此细胞未受损伤；②细胞内的全部关键靶区被击中，细胞将在下一代或以后的有丝分裂过程中死亡；③细胞内的某些而不是全部靶区被击中，细胞受到亚致死性损伤，但并不死亡，在供给能量和营养的情况下，经过一定时间（约1小时），细胞所受损伤能被修复，称为亚致死性损伤修复（sublethal damage repair，SLDR）。如果在修复之前再累积损伤，细胞则可能死亡。
SLDR只有在分割剂量实验中才能表现出来，此时将1个剂量分割为2个较小剂量，中间相隔几小时，细胞存活率就会增高。如果在第1次照射之后没有损伤修复，第2次照射后所得的细胞存活分数应与未分割照射的结果一样，而实际上两者相差数倍。从另一个角度可进一步理解亚致死性损伤的修复。将分割剂量照射与单次急性照射相比，引起同等的细胞存活率降低所需的总剂量（即分割剂量之和）明显大于单次急性照射剂量。
五、细胞的死亡
国际细胞死亡命名委员会（Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）建议，出现下述任何一条分子学或形态学改变即可定义为细胞死亡：①细胞丧失细胞膜完整性，体外活性染料（如碘化丙啶）能够渗入细胞；②细胞（包括细胞核）彻底碎裂成为离散的小体；③在体内，细胞残骸（或其一部分）被邻近细胞吞噬。细胞死亡依据功能分类，分为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）和非程序性细胞死亡；前者是细胞主动的死亡过程，能够被细胞信号转导的抑制剂所阻断，如凋亡（apoptosis）、坏死状凋亡（necroptosis）、自噬（autophagy）、焦亡（pyroptosis）、有丝分裂灾难（mitotic catastrophe）等，后者主要表现为坏死（necrosis）。
1.凋亡与自噬性死亡
细胞凋亡是一种主动的由基因导向的细胞消亡过程，在维持机体内稳态，胚胎发生、器官发育与退化、免疫和造血细胞的分化、选择及细胞更新等方面都有重要意义。在生理过程中，在一定的信号启动下，凋亡相关基因有序地表达，制约着对整体无用或有害细胞的清除，即为细胞凋亡。细胞凋亡和细胞增殖互相协调，彼此消长，维护着机体的正常生长、发育。电离辐射可促进这一过程，但并非引起细胞凋亡的唯一因素。
细胞自噬广泛存在于真核细胞中，是细胞在饥饿、缺氧及应激等压力下，被诱导出的选择性或非选择性自我分解细胞组分，以回收部分蛋白，维持细胞所必需的代谢或清除受损伤组织，维持基因组稳定性的一种方式。细胞可通过自噬清除细胞内过多或异常的蛋白质、细胞器，甚至病原微生物，这不仅有利于维持细胞稳态，也促进氨基酸等物质的循环再利用，为多种生化进程提供底物或原料。电离辐射诱导细胞发生自噬性死亡尤其体现在上皮性细胞。
2.坏死性细胞死亡
细胞坏死是指细胞受到环境中的物理或化学刺激时发生的细胞被动死亡。细胞坏死的特征是细胞器肿胀，膜系和细胞器破坏，整个细胞崩解，细胞内容物和炎症因子释放，趋化炎性细胞浸润而引起炎症反应。
程序性坏死（坏死状凋亡）存在caspase非依赖性途径，涉及信号活化和转导；在发育过程中，通常与细胞凋亡同时发生，如动物指/趾发育过程中的指间细胞（interdigital cell）死亡存在该死亡方式，也可参与排卵、软骨细胞死亡及小肠和大肠细胞的更新。坏死性细胞死亡通常与病理性死亡过程相关。
六、电离辐射诱导细胞恶性转化
1.细胞恶性转化的机制
细胞的恶性转化是一个涉及多种遗传学改变的复杂过程。研究证实，诱发体外细胞恶性转化的主靶是基因组DNA。电离辐射主要是通过诱导多种细胞遗传学变化，包括基因点突变及基因放大、染色体易位、缺失及重排等，启动细胞恶性转化的过程。
细胞增殖受控于影响细胞分裂及分化的信号，包括正向和负向信号通路的调控。参与细胞增殖正向和负向调控的重要基因包括癌基因和抑癌基因。细胞的恶性转化可能是由于癌基因突变使之功能激活（细胞恶性转化的阳性效应器），或是由于抑癌基因突变使其蛋白产物的功能丢失（细胞生长的阴性调节器）所致。
癌基因（oncogenes）或称原癌基因（protooncogenes），存在于每一个哺乳动物细胞中，具有调控细胞生长的功能。癌基因首先是在逆转录病毒的研究中发现的，逆转录病毒可使细胞内基因发生突变，诱发癌症。病毒引起细胞恶性转化是通过将其自身基因组中的癌基因插入正常细胞中所致，然而电离辐射或化学物质所致细胞恶性转化的机制则是引起细胞固有的原癌基因的变化而使之激活。
电离辐射或化学物质使原癌基因激活，引起细胞恶性转化的主要机制有3个方面：①点突变，即单个碱基的变化，使原癌基因激活并过表达，产生一个单个氨基酸变化的蛋白，如在结肠癌患者癌细胞中发现k-ras基因的点突变；②染色体重排或易位，导致原癌基因过度表达或产生一个新的融合基因，其蛋白产物获得了新的致恶性转化活性，电离辐射可高效引起细胞DNA链断裂，断裂的染色体可重排形成双着丝粒染色体及等数量的染色体易位，使原癌基因激活并过表达，如在Burkitt’s淋巴瘤细胞，染色体2与染色体8的易位可使myc基因激活，同样染色体重排可使c-fos基因激活；③基因放大可使细胞中原癌基因形成多拷贝，伴有癌基因的激活及表达，N-myc基因的放大是许多神经母细胞瘤所特有的。
体内还有抑癌基因（tumor suppressor gene），即正常细胞含有能抑制肿瘤细胞恶性程度的抑癌基因。因此，癌基因的激活和抑癌基因的功能丧失，可能是电离辐射致细胞恶性转化的重要的分子基础。
细胞的恶性转化并不等于癌症。免疫系统对恶性转化的细胞有监视作用。被免疫细胞识别的新生恶性细胞可在其形成肿瘤之前被抑制或消灭。癌症发生的长潜伏期可能与免疫系统控制潜伏的恶性细胞有关。电离辐射达到一定剂量时可抑制免疫功能，使免疫系统对肿瘤的监视作用减弱，促进癌症的发生。另外，在由恶性转化细胞向癌症发展的过程中，往往需要促进因子的作用。促进因子本身可以是致癌剂，也可不是。
应当指出，电离辐射在体外诱导细胞转化的效率要比许多化学致癌剂低。电离辐射引起体外细胞恶性转化的实验结果与其体内致癌效应相吻合，在人体和动物细胞都得到证实。
2.细胞恶性转化的特性
（1）饱和密度、胞膜运输能力和流动性增加：
当正常细胞停止生长时，转化细胞仍继续生长。转化细胞膜对某些糖类和氨基酸的通透性明显增加，以适应细胞迅速增长的需要。由于膜成分的改变，胞膜的流动性增强，细胞易于变形、移动，为浸润转移提供了条件。
（2）对生长因子和营养物质的需要降低：
转化细胞失去了对激素和生长因子的需求，这可能是由于某些转化细胞产生生长因子类似物，为其自身提供了生长因子。当所需要的任何一种关键性生长因子或营养物质降低到阈值以下时，正常细胞生长即受到抑制。
（3）生长抑制性丧失：
当所需要的任何一种关键性营养物质或生长因子降低到阈值以下时，正常细胞生长即受到抑制。例如：当亮氨酸、磷酸盐、表皮生长因子或其他调节生长的物质浓度降至所需水平以下时，正常细胞即趋于静止状态；而转化细胞则与此相反，仍可继续生长，甚至可以杀死一些自身细胞，以便在不可能生存的环境下继续生长。
（4）生长停泊依赖丧失：
正常贴壁细胞需要与适于生长的物质密切接触才能生长，而转化细胞则失去了对贴壁的依赖性，没有与某些物质的黏附，细胞仍能生长。这种特性与转化细胞形成肿瘤的能力极其相关。当失去停泊依赖性的细胞被注射到无排斥反应的动物体内时，通常能形成肿瘤。
（5）接触抑制性丧失：
当一个正常细胞被其他细胞包围时，不再运动，并与周围细胞形成缝隙连接，这种现象称为运动的接触抑制性。转化细胞则缺乏运动的接触抑制性，可以在彼此的顶部生长，很少形成缝隙连接。
（6）细胞形态学和生长习性的改变：
转化细胞在形态和外观上与其母本细胞明显不同，由于其生长停泊依赖性丧失，与某些物质的黏附性显著降低，因此细胞趋于圆形，少突起。转化细胞由于接触抑制性的丧失，能够多层生长；而正常细胞则成单层生长，仅在培养瓶的边缘有细胞重叠现象。
（7）细胞生长异常：
转化细胞增殖失控（uncontrollable proliferation）不受正常神经内分泌的调节，即使处于营养不良状态，仍继续自主性生长。当培养中生长活力有限的细胞株被用作转化细胞的靶细胞时，转化刺激可使细胞转化成永久生长的细胞系。转化刺激产生这种永久性细胞系的难易程度取决于细胞自然获得永久性生长的倾向。
（8）细胞表面成分的变化：
正常细胞表面有非常丰富的糖脂和糖蛋白，但在转化细胞则常被修饰。例如：与蛋白连接的N-乙酰神经氨酸含量降低，脂类的神经节苷脂部分降低，而膜的一般结构并未改变。由于脂质固有的易变性并不大，因此很可能在表面蛋白质与其下面细胞骨架成分之间的接触受到转化细胞的修饰。这样一种修饰后的连接，可能成为转化细胞形态学变化的基础。
（9）易被凝集素所凝集：
植物凝集素是对特异性糖有多个结合部位的植物蛋白。转化细胞凝集所需凝集素浓度比正常细胞低得多。易于凝集并非由于结合位点的密度增高，而可能是细胞表面糖蛋白活性的增高所致，后者允许低浓度的凝集素在细胞表面形成受体——凝集素复合物“帽”，在特定细胞上的“帽”能通过凝集素与另一个细胞上的“帽”交联，导致细胞凝集。
（10）葡萄糖转运增加：
转化细胞比正常细胞能更快地转运葡萄糖。动力学研究表明，糖与受体结合反应的Km并未改变，但最大反应速率（Vmax）增加。这表明细胞表面有更多的转运蛋白可供使用；也可能是由于转化细胞糖酵解活性增加，使其对糖转运的需要增加。
（11）表面纤连蛋白减少或缺失：
单层培养中的正常静止细胞被以纤连蛋白为主要成分的稠密原纤维网所覆盖，甚至生长期细胞也有纤连蛋白散在性覆盖。而转化细胞的纤连蛋白大大减少，甚至完全缺失。当加入高浓度来自正常细胞的纯纤连蛋白，可导致很多肿瘤细胞变成扁平状或出现类似于正常细胞的外形。因此，纤连蛋白的丧失可能是导致细胞转化的一个重要因素。
（12）肌动蛋白的微丝丧失：
转化细胞不仅在细胞表面与正常细胞不同，而且在细胞骨架上二者也有明显不同。扩张正常细胞长度的肌动蛋白微丝呈弥散分布，或浓集在细胞膜下。转化细胞骨架成分肌动蛋白微丝的丧失可能是影响细胞表面蛋白发挥作用的一个原因。
（13）转化生长因子的分泌：
转化细胞能分泌转化生长因子（transforming growth factor，TGF），这在胚胎中也得到证实，表明TGF在转化细胞及正常细胞均起作用。
（14）蛋白酶的分泌：
转化细胞常分泌一种称作纤溶酶原激活剂的蛋白酶，能裂解血清纤溶蛋白的肽键，使纤溶酶原转化成纤溶酶。正常细胞经外源性蛋白酶处理，能导致细胞出现类似转化的某些改变（如肌动蛋白微丝丧失等）。因此，纤维酶原激活剂的分泌可能有助于维持某些细胞系的转化状态。另外，纤维酶原激活剂的分泌可能对转化细胞和肿瘤细胞的侵袭性有重要作用，纤溶酶的增加有助于肿瘤细胞浸润到基底膜。
（15）永久性生长：
许多动物的非贴壁细胞（如白细胞）很容易转化成为永久性细胞系，人的贴壁细胞很少成为永久性细胞系，但鼠的贴壁细胞则很容易转化成永久性细胞系。转化刺激产生这种永久性细胞系的难易程度取决于细胞自然获得永久性生长的倾向。
七、对细胞周期的影响
细胞受照射后有丝分裂周期的进程发生变化，最终表现为有丝分裂的延迟，其特点是具有可逆性和明显的剂量依赖性。
电离辐射照射后使处于周期中的细胞暂时停留在G1期，称为辐射诱导的G1期阻滞，其阻滞的程度与时间取决于细胞所受照射的剂量。目前认为并非所有的细胞系在照射后都出现G1期阻滞，G1期阻滞的出现取决于细胞系的p53状态。电离辐射后也使处于周期中的细胞暂时停留在G2期称为辐射诱导的G2期阻滞，不进入M期，因此G2期细胞堆积，经过一定时间后，大量细胞同时进入M期。电离辐射使细胞通过S期的进程减慢，称为S期延迟，与DNA合成速率下降有关。而细胞周期解偶联，是指处于细胞周期中的G2期细胞既不能进入有丝分裂M期，也不发生G2期阻滞，而是返回到S期，继续进行DNA复制，使细胞形成内含数倍DNA而不进行分裂的巨细胞，最终导致细胞死亡。
（刘晓冬 田 野）