包含体（inclusion bodies，IBs）是外源蛋白在宿主系统中高水平表达时形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，直径0.1～3.0μm，呈现出无规则或类晶体的结构，难溶于水，可溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包含体主要成分一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、外膜蛋白、脂类、脂多糖、核酸等杂质。重组蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质，必须将包含体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。蛋白质的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，这无疑加大了下游工作的难度。但以包含体的形成表达的重组蛋白与可溶形式表达重组蛋白相比，也具有一定的优势：即包含体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解；可降低胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高；包含体中杂蛋白含量较低，有利于分离纯化；表达对宿主细胞有毒害的蛋白质时，包含体形式无疑是最佳选择等。因此，只要解决蛋白质复性问题，即将无活性的包含体在体外成功转变成为有生物学活性的蛋白质，将成为大量生产重组蛋白质最有效的途径。目前，较成功的包含体形式表达蛋白开发成为产品的有重组人白细胞介素-2（rhIL-2）和重组人干扰素α（rhIFNα）等。

重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系，都可能形成包含体。包含体形成比较复杂，目前关于包含体的形成机制尚未完全清楚，一般认为与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的蛋白质合成速度过快，无充足的时间进行折叠，二硫键不能正确地配对，从而形成非结晶、无定形的蛋白质聚集体；重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，导致无法形成正确折叠；重组蛋白的氨基酸中含硫氨基酸越多越易形成包含体，而脯氨酸的含量明显与包含体的形成呈正相关；重组蛋白是大肠埃希菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，而使中间体产物大量积累，导致包含体形成及 E. coli胞质内酸性成分与外源蛋白的紧密结合促进蛋白聚合。包含体形成的动力学控制过程，可用下述竞争反应动力学描述（图4-5）。

由模型可知包含体的形成反应在分子间发生，其反应速率与浓度成正比。当形成天然构象蛋白速度缓慢，新生肽浓度增加和中间肽的疏水性相互作用都可能导致包含体的形成。此外，包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH、诱导剂等因素有关。因此，为增加重组蛋白的可溶性表达量，一般常采用降低底物浓度及温度控制生长速率；发酵液pH远离蛋白的等电点；通过流加诱导剂控制诱导剂浓度及添加促可溶性表达的生长添加剂（多醇类、蔗糖）等方法。

破碎细胞释放出以包含体形式存在的目标蛋白，包含体为致密凝聚体，密度较大，低速离心或过滤即可与可溶性蛋白及细胞碎片等分离。在粗制包含体中，除了目标蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和膜蛋白等杂质，且脂类及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包含体粘连在一起，因此在溶解包含体前应先洗涤包含体。通常用低浓度的变性剂如2mol/L尿素（或盐酸胍）在50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA（pH7.0～8.5）中洗涤。低浓度的尿素和盐酸胍能够增加部分杂蛋白质的溶解性，从而可以选择性地去除被溶解的杂蛋白；EDTA的主要作用为螯合金属离子，减少对目标蛋白进一步氧化作用，同时还能起到破坏细胞内膜的作用。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。经过洗涤，包含体的主要成分为集聚态的不溶解于水溶液的目标蛋白，其电泳纯度一般高于60%。

包含体中蛋白质的聚集主要是由疏水作用力、氢键、离子键和二硫键等维持。因此溶解包含体常要考虑变性剂的浓度、温度、作用时间、溶液离子强度、pH以及蛋白质浓度与变性剂浓度之比等因素。常用的变性剂有尿素（8～10mol/L）、盐酸胍（6～8mol/L），通过离子间的相互作用，破坏包含体蛋白间的氢键，引起天然构象解体而溶解包含体蛋白，变性不涉及共价键的破裂，一级结构保持完好。尿素、盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤去除，其中盐酸胍的增溶效果较尿素好。有些蛋白质含有两个以上二硫键，这种情况下还需添加还原剂切断二硫键。常用还原剂是二硫苏糖醇（DTT）和β-巯基乙醇（β-ME）和还原型谷胱甘肽，浓度一般为1～50mmol/L，另外还需要EDTA螯合金属离子，来防止目的蛋白在溶解过程中过度氧化。还可以添加去垢剂如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），可以破坏蛋白质内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于SDS无法彻底地去除而不允许在制药过程中使用。还可以采用极端pH破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，但只适合于少部分蛋白的增溶。尿素在碱性环境中不稳定，一般调节pH 8.0～9.0，最好是现用现配，增溶时一般在磁力搅拌下室温过夜；盐酸胍的增溶性较尿素强，一般在37℃、1小时便可使多数蛋白质完全变性溶解。

蛋白质复性又称再折叠，是指变性蛋白质在变性剂去除或浓度降低后，就会自发地从变性的热力学不稳定状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物学功能的天然结构。一般蛋白质的复性收率仅为20%～40%，因此复性是以包含体形式存在的重组蛋白生产最为关键的技术之一，是限制包含体形式表达产物产业化的瓶颈。

一个有效的、理想的复性方法应具有活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后可得到浓度较高的蛋白质产品；复性方法周期短；易于放大等特点。迄今为止，不同重组蛋白质其具体适用的复性方法和条件各不相同，尚无可以普遍应用于每种蛋白质的复性方法。现将常用的复性方法介绍如下：

直接加入水或缓冲溶液，放置过夜即可，是最简单有效的复性方法。缺点是体积增加较大，一般稀释40～50倍；变性剂稀释速度过快，不易控制。采用的方式一般有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

透析是将变性溶解的包含体蛋白置于透析袋中，通过缓冲液交换的方法，除去变性剂使蛋白质折叠复性。透析复性一般不增加体积，但耗时长，不适合大规模生产且容易形成没有活性的蛋白质聚集体。采用的方式一般有直接透析法和梯度透析法，与直接透析法相比，使用梯度透析的方法可以取得较高的复性收率。

选择合适截留分子量的膜，允许变性剂通过而不允许蛋白质通过，去除变性剂，使蛋白复性。优点是蛋白浓度保持不变，处理量大，易于控制透析速度。缺点是易造成膜污染，有些蛋白在超滤过程中会产生不可逆变性。

近几年，层析复性是研究较多并成功应用于生产中的一种色谱复性技术，该技术是通过将变性溶解的包含体蛋白上样，并经过梯度洗脱及改变pH等方法，逐渐去除变性剂使蛋白恢复天然结构，并与其他杂蛋白进行分离。与传统的稀释和透析复性方法相比，柱上层析自动化程度高、重现性好，复性样品处理量大，可实现高浓度复性，利于产业化；有效地限制和减少了聚集反应，有利于提高复性率；复性和纯化过程同步完成，缩短生产周期。常用的方法有离子交换法（IEC）、凝胶过滤层析法（GFC）、疏水层析法（HIC）、亲和层析法（AFC）等。

离子交换法是利用离子交换剂为固定相，利用变性蛋白与固定相之间所带电荷不同，变性蛋白吸附于固定相表面，从而避免了复性过程中蛋白质的聚集作用。并在洗脱过程中通过吸附-解吸附-再吸附的过程，促使变性蛋白向有活性的天然形式转变，与其他杂蛋白相分离。并进一步发展了双梯度离子交换层析复性蛋白质的方法，通过在洗脱的过程中逐渐降低变性剂浓度和调节pH，提高活性收率，上样量大，适合于规模化生产。

凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性（SEC），是利用有一定孔径的凝胶为固定相，根据包含体溶液中目标蛋白与变性剂相对分子质量的差别，在固定相中两者洗脱速率不同，达到去除变性剂使目标蛋白复性的目的。凝胶过滤复性时，蛋白质与介质之间并不发生其他任何作用，复性过程始终发生在溶液中。随着变性剂和蛋白质浓度降低，变性蛋白质分子开始复性，并开始在液-固两相间进行分配。蛋白质分子量大先流出，变性剂分子量小后流出。此外在脲梯度SEC的基础上发展了pH和脲浓度双梯度法用于蛋白复性。与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化，但上样量仅为柱床体积的10%，不适用于规模化生产。

疏水色谱是利用疏水性吸附剂为固定相，利用蛋白质与介质间疏水性相互作用的差别进行蛋白质分离纯化。蛋白质变性后，疏水基团暴露在分子表面，进入HIC柱后，变性蛋白被固定相吸附，随洗脱液离子强度的减小，不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附，并在此过程中促使蛋白质发生折叠逐渐被复性。蛋白活性收率较稀释、透析复性有较大程度提高。HIC在蛋白质复性的同时还能与其他杂蛋白进行很好的分离，快速简便，具有很好的发展潜力。

亲和层析是利用固定相中的配体与目的蛋白质间特异性吸附作用，将目的蛋白与变性剂分离，并在洗脱过程中实现蛋白复性。按照偶联亲和配体不同分为可分为金属离子亲和层析、分子伴侣亲和层析及脂质体亲和层析等。

利用扩张床的吸附层析直接从变性蛋白中捕获并复性目的蛋白。当变性蛋白以一定流速通过吸附床，实现床层的膨胀但不流化，细胞碎片和不吸附的杂质流穿，目的蛋白吸附在固定相上，用含有变性剂的缓冲溶液清洗残余杂质，再用不含变性剂的缓冲溶液洗掉变性剂。当扩张床沉降后，再用缓冲溶液将目的蛋白洗脱下来并得以复性。该方法具有处理量大、蛋白浓度高、减少操作步骤及可重复生产的优点。

双水相体系中加入盐酸胍，再加入变性蛋白质溶液，使其向某一水相分配过程中逐渐得以复性，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。

由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，有效避免蛋白质间的相互聚集作用，通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，可使变性蛋白质二硫键再氧化重排得到复性，再去除表面活性剂，即可获得高活性蛋白质。

蛋白质复性是非常复杂的过程，复性收率的高低既与蛋白质本身性质相关，也与变性蛋白的浓度、pH、复性时间、温度等相关环境因素和操作条件相关。在复性过程中为增加复性效率，通过添加不同化合物，抑制无规则聚集来促进蛋白复性。复性常用的添加剂及其作用见表4-9。

蛋白质复性过程易发生错误折叠、聚集，形成多聚体或异构体等影响蛋白的活性及安全性。因此应根据蛋白的性质和需要从生化、免疫、活性、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测（表4-10）。