DNA聚合酶（DNA polymerase）的共同特点是能够将脱氧核糖核苷酸连续加至双链DNA分子引物链的3'-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，但不从引物模板解离。该酶催化反应时必须具备DNA模板、3'-OH的引物及其他必需因子，合成DNA的方向是5'-3'。在基因工程中应用较多的DNA聚合酶主要有大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ、大肠埃希菌DNA酶Ⅰ的大片段（Klenow酶）、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶及逆转录酶等。DNA聚合酶的特性如表3-3所示。

迄今为止，从大肠埃希菌中分离获得了3种DNA聚合酶，即DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）、DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）、DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）。其中polⅠ和polⅡ主要参与DNA修复过程，而polⅢ则与DNA复制相关。基因工程中主要应用的是DNA聚合酶Ⅰ。1957年Kornberg从大肠埃希菌中首次发现了polⅠ，该酶是一种单链多肽，分子量为1.09×10 ³，具有3种酶活性：5'-3'聚合酶活性、5'-3'核酸外切酶活性、3'-5'核酸外切酶活性。

大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（ E. coli DNA polⅠKlenow fragment）是大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ经枯草芽胞杆菌蛋白酶或胰蛋白酶水解后，得到的较大的片段，相对分子量为7.6×10 ⁴。Klenow片段保留了完整的5'-3'聚合酶活性和3'-5'核酸外切酶活性。该酶主要用于修补限制性内切酶酶切DNA形成的3'隐蔽末端、标记DNA片段末端、cDNA第二条链的合成以及DNA序列测定。

T4 DNA聚合酶是分离自T4噬菌体感染的大肠埃希菌的一种DNA聚合酶，需要模板和带有3'-OH末端的引物，具有5'-3'聚合酶活性，DNA链从该3'-OH起始，按5'-3'方向延伸，该酶还具有3'-5'核酸外切酶活性，但没有5'-3'外切酶活性。相对分子量为1.14×10 ⁵，外切酶活性较Klenow酶高200倍，且对单链DNA作用强于双链DNA。目前商品酶多分离自基因工程大肠埃希菌，主要用于补平5'凸出末端，进行放射性标记；也可用于切平3'凸出末端。

分离自T7噬菌体感染的大肠埃希菌的一种DNA聚合酶，具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'核酸外切酶活性，其单链或双链外切酶活性是Klenow酶的1000倍。能利用引物在单链模板上退火合成DNA，因此多用于测序，是双脱氧末端终止法的测序酶。该酶在所有DNA聚合酶活性中活性最强，可延伸引物长达1000个核苷酸，因此也适用于合成较长的DNA链。

测序酶（sequenase）是一种经化学修饰的T7 DNA聚合酶，修饰后丧失了3'-5'核酸外切酶活性，稳定性增加，持续合成能力强，聚合速率高，是对长DNA片段进行双脱氧终止法测序最好的酶。

1970年两位美国科学家各自在反转录病毒中发现了逆转录酶（reverse transcriptase），该酶催化以RNA为模板合成DNA的反应，其产物为cDNA。目前该酶主要有两种，一种来源于禽成髓细胞瘤病毒，另一种则分离自克隆Moloney鼠白血病病毒逆转录酶基因的大肠埃希菌。两者均具有5'-3'聚合酶活性，能以RNA或DNA为模板合成DNA；具有RNA酶H活性，即核糖核酸外切酶活性，以3'-5'方向或5'-3'方向特异降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。

从耐热菌 T. aquaticus中分离获得Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），该酶具有5'-3'聚合酶活性及依赖于聚合酶作用的核酸外切酶活性，其特点是在DNA变性温度下仍具有很高活性，因此能以高温变性的DNA为模板合成DNA新链，最适反应温度为75～80℃，主要用于聚合酶链式反应（PCR）在体外扩增DNA。

末端转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）是一种无须引物即能将若干碱基加在双链或单链DNA 3'末端的酶，利用这一特点可进行3'末端加尾或标记。TdT催化反应需要Mg ^2＋，若以Co ^2＋代替，则可将同聚体“尾”加至由限制性内切酶酶切产生的平末端或黏末端的3'-OH部位。该酶是一种非特异的酶，4种dNTP中任何一种均可作为其前体物。