脊椎动物的免疫系统受外来抗原的刺激后，通过免疫细胞介导，一般均能产生抗体，分泌到血液或其他分泌物中，防御病毒、细菌及真菌感染。在胚胎发育阶段，免疫系统将所有组织器官皆识别为“自身物质”，对外来蛋白具有极大容忍度。在出生前或出生后不久，机体免疫系统开始发育完善，能识别“自身物质”与“外来物质”，具备产生抗体的能力。“外来物质”（抗原）进入机体后一部分被抗原呈递细胞（如树突细胞、单核细胞、巨噬细胞等）捕获，加工处理后递呈给辅助性T细胞（如Th1细胞、Th2细胞等），使辅助性T细胞活化；另一部分抗原直接与B细胞抗原受体结合，刺激B细胞活化。同时活化的辅助性T细胞再次刺激B细胞，B细胞即可产生抗体。B细胞开始时一般产生IgM型抗体，随后在抗原刺激下通过重链C区基因的重排产生IgG型抗体和IgA型抗体。抗原决定簇决定抗原的特异性。具有单一决定簇的抗原刺激机体后，通常只产生识别单一抗原决定簇的同源抗体，即单克隆抗体。若一个携带多个决定簇的抗原刺激机体，相应地就会产生多种单克隆抗体，这些抗体混杂在一起就称为多克隆抗体。

依据技术途径不同，抗体制备方法有3类：免疫动物途径、杂交瘤技术、基因工程技术。免疫动物途径是传统的抗体制备方法，所制备的抗体属多克隆抗体。杂交瘤技术获得的抗体一般为单克隆抗体。利用基因工程技术制备的抗体为基因工程抗体。不同方法制备的抗体各有其优点和缺陷，可依据用途选择合适的抗体制备方法。在免疫动物时，为了提高抗体效价，需给动物注射免疫佐剂。免疫佐剂是指免疫动物时与免疫原同时注射或提前注射的，可增强动物对免疫原的特异性应答或改变免疫应答类型的物质。

免疫佐剂是一种免疫调节剂，可增强免疫原的免疫原性，提高其免疫效果，增强机体针对免疫原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的制剂。1926年Glenny发现明矾沉淀白喉毒素所产生的微粒能显著增强机体对免疫原的特异性应答，自此免疫佐剂进入实际应用。随着研究的深入，越来越多的物质可作为免疫佐剂。免疫佐剂通过改变免疫原的物理性状，延缓免疫原被降解和排出，增加了免疫原在体内的滞留时间，有效地刺激了机体的免疫系统，提高了机体免疫应答产生抗体的滴度或改变抗体产生类型。免疫佐剂应当无毒性或副作用小，使得最少量免疫原进行最少次的接种产生足够的免疫应答效果。

依据来源和物质性质不同，免疫佐剂可分6类：矿物盐佐剂、矿物油佐剂、细菌佐剂、细胞因子佐剂、植物来源佐剂、核酸佐剂。

矿物盐佐剂常见的有铝佐剂、磷酸钙佐剂及氢氧化铁佐剂。铝佐剂可激活Th2细胞，释放IL-4细胞因子，产生高效价的IgG抗体和IgE抗体，在制备白喉、麻疹及破伤风疫苗时一般使用铝佐剂。磷酸钙佐剂增强免疫应答的机制与铝佐剂相似，不同之处是它不会产生IgE抗体，国外已将磷酸钙佐剂应用于卡介苗、白百破、乙型肝炎等疫苗的制备。氢氧化铁佐剂可同时增强机体的体液免疫和细胞免疫，具有较好的应用前景。

常见的矿物油佐剂有弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、MF59佐剂。弗氏不完全佐剂是由矿物油（75%～85%）和乳化剂（15%～25%）混合而成，若再加入0.5g/L卡介苗即为弗氏完全佐剂。弗氏完全佐剂能同时增强体液免疫和细胞免疫，而弗氏不完全佐剂仅能诱导Th2细胞释放细胞因子。弗氏佐剂注射机体常在注射部位形成小结和肉芽肿。MF59佐剂包含1%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%三油酸聚山梨酯，在欧美国家已成功使用了20余年，如制备流感疫苗、C群脑膜炎球菌疫苗等，对相同剂量的免疫原，用MF59佐剂比铝佐剂产生的抗体效价高3～50倍，所引起的组织病理学变化也较弱，对动物胚胎也无致畸毒性。

细菌佐剂主要指微生物及成分来源的佐剂，如卡介苗、百日咳杆菌、短小棒状杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽及其衍生物、霍乱毒素等。无毒的微生物菌体可作为免疫佐剂，如牛型结核分枝杆菌、百日咳杆菌及短小棒状杆菌等，在临床应用已获得成功。脂多糖是细菌内毒素，作为免疫佐剂在动物体内作用和功能已被证实。胞壁酰二肽及其衍生物单独注射可增强机体的非特异性免疫功能，作为免疫佐剂可同时增强体液免疫和细胞免疫应答。霍乱毒素是一种不耐热肠毒素，作为免疫佐剂可增强体液免疫和细胞免疫功能。

细胞因子是由活化的免疫细胞或一些基质细胞所分泌的具有高活性、多功能的小分子蛋白质或多肽。作为免疫系统细胞间相互作用的信号分子，细胞因子与细胞膜上相应受体结合后发挥多种生物效应，在免疫应答、免疫调节、炎症反应中具有重要作用，因此细胞因子具有免疫佐剂的效应。细胞因子佐剂可增强病毒疫苗、细菌疫苗及寄生虫疫苗的免疫效果，同时可发挥抗肿瘤作用。可作为佐剂的细胞因子有干扰素、淋巴细胞因子、单核细胞因子等，因是机体分泌分子，细胞因子作为佐剂无毒副作用。

一些从植物来源成分如皂苷Quil A、Quil A复合物、蜂胶等均可作为佐剂。皂苷Quil A已用于制备猪口蹄疫疫苗，但人用疫苗没有使用皂苷Quil A佐剂。由皂苷Quil A制备的QS-21已被用于HIV-1亚单位疫苗的临床研究。Quil A与胆固醇、类脂混在一起的Quil A复合物作为佐剂，可将蛋白免疫原包裹在微泡内，形成免疫刺激复合物，免疫动物有更大优势。Quil A免疫刺激复合物可刺激B细胞，产生更多抗体，另一方面，它同时刺激T细胞，增强细胞免疫功能，Quil A单独使用有一定的毒性，若形成免疫刺激复合物时其毒性大为降低，表现出良好免疫佐剂作用。蜂胶是由一些植物分泌的树脂混合蜂分泌物、花粉等天然物质形成的，蜂胶作为免疫佐剂可同时增强体液免疫和细胞免疫功能，也能促进补体功能，以蜂胶为佐剂制备的疫苗有禽霍乱疫苗、猪细小病毒疫苗等。

脊椎动物在进化过程中逐渐形成了对微生物的天然识别，主要是由免疫细胞膜上的结构识别受体识别侵入体内的病原微生物，能被识别的成分较多，其中细菌和病毒DNA是被识别的成分之一。当免疫细胞结构识别受体与病原微生物的非甲基化CpG序列结合后，就会激发非特异性免疫应答反应，如激活NK细胞和B淋巴细胞。鉴于CpG序列能激活非特异性免疫应答，研究人员利用含CpG序列的DNA链作为免疫佐剂。核酸佐剂是指具有免疫刺激作用的DNA序列，在核酸佐剂中以人工合成CpG DNA最常用，细菌质粒DNA也可作核酸佐剂，它们能刺激动物或人体Th1细胞诱导的细胞免疫反应。核酸佐剂是新型免疫佐剂，目前处于临床试验阶段的佐剂种类较多，但没有商品化的核酸佐剂。

以上介绍的是目前免疫和疫苗研究过程中应用较多的几类免疫佐剂。理想的佐剂应该是广谱、无毒性、对免疫系统具备有效的激活作用，同时易于生产和使用，目前还没有一种佐剂可同时具备这些要求。随着对各种病原体抗原成分的进一步研究和抗感染免疫机制的深入探讨，将来研发的免疫佐剂会更具有目标性。

免疫佐剂的作用机制并不完全清楚，不同佐剂增强免疫应答的机制也不尽相同，归纳起来主要有3类：抗原递呈、抗原靶向、免疫调节。

免疫佐剂可改变免疫原的物理性状，有利于抗原呈递细胞对免疫原的摄取，降低免疫原被降解的速度，有助于免疫原被主要组织相容性复合体分子结合、运输、递呈给免疫效应细胞。

佐剂可吸引巨噬细胞到达免疫原存在的组织部位，并活化巨噬细胞，促进免疫原与细胞受体结合，诱导产生免疫应答。

佐剂可以修饰免疫效应细胞对免疫原进行修饰，改变免疫应答的强度或类型。同一免疫原与不同的佐剂联用，可产生不同的免疫反应。佐剂还可直接刺激淋巴细胞增殖分化，增强免疫应答。

天然抗原常含有多个抗原决定簇，免疫动物后将会产生针对不同抗原决定簇的抗体混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体在生物学研究方面有广泛用途如免疫印迹、免疫共沉淀、免疫测定及免疫治疗等。不同实验室会采用不同方案免疫动物，但一般都会获得满意的抗体。尽管免疫山羊或绵羊能获得更大量的多克隆抗体，但免疫兔获得的抗体即用性好，抗体质量高，容易获得检测用的二抗。采集免疫动物的血液可获得多克隆抗体，然后对抗体进行纯化和检测。

制备多克隆抗体可供选择的动物有家兔、绵羊、山羊、大鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、马等，具体选何种动物需考虑动物的种系关系、抗原性质、抗体用量、动物个体因素等。

一般来说，免疫原来源动物与被免疫动物间亲缘关系越远，其同源蛋白间氨基酸序列差异就越大，免疫所获得抗体效价就越高，抗体多样性更丰富；亲缘关系越近，越难产生抗体；以较远亲缘关系动物的大分子复合蛋白对哺乳类动物进行超免疫接种能获得10g/L的特异性多克隆抗体，而用同种异型蛋白进行超免疫接种时，仅能获得1g/L的特异性抗体。

不同性质的免疫原对不同动物有不同的免疫效果，因此应针对免疫原的不同性质选择不同动物进行免疫。蛋白类免疫原一般适合免疫大部分动物，酶类免疫原多选择豚鼠免疫，甾体激素类免疫原多选择家兔进行免疫；但一些蛋白类免疫原对个别种类动物免疫效果较差，如胰岛素免疫家兔、IgE免疫绵羊、胃蛋白酶原免疫山羊等，这就需要选择合适的动物进行免疫。

需要较大量的抗体时一般选择马、绵羊等大动物，需要抗体量较少时可以选择家兔、豚鼠、鸡等；选用动物不同，产生抗体反应比例范围及用途有所不同，如免疫家兔等产生的抗体有较宽的抗原抗体反应比例范围，适合作诊断试剂，而马等大动物产生的抗体的抗原抗体反应比例范围较窄，一般应用于免疫治疗。

动物年龄、性别等均可影响多克隆抗体的制备，动物免疫功能在青春期达到顶峰，其后随年龄增长而逐渐减退，细胞免疫功能减退早于体液免疫功能的减退，因此免疫青壮年动物所产生的抗体在品质上优于老龄动物，其抗体产生期限也较长。雌性和雄性动物一般均可获得满意的免疫效果，但由于雌性动物驯顺、易于操纵，因而更为常用；对大型动物往往进行去势，使其失去生育能力，以获得更好的免疫效果。

免疫动物时，免疫原的剂量较为关键，过多免疫原可引起免疫耐受，过少免疫原不能引起足够强的免疫刺激，确定免疫原剂量需综合考虑免疫原的免疫原性强弱、免疫原分子量大小、免疫周期及动物种类等。在一定范围内，产生抗体的效价随注射的免疫原剂量的增加而升高。一般来说，蛋白类免疫原的免疫剂量比多糖类免疫原宽。免疫原剂量随动物重量增加而提高，以初次免疫为例，小鼠免疫剂量为50～400μg，家兔为500～1000μg，绵羊为500～5000μg。若免疫原是由半抗原合成的，则用量需增加，如初次免疫家兔需2000μg（其中半抗原量为20～200μg）。对动物进行再次免疫时，需降低免疫原剂量，一般为初次免疫剂量的1/5～2/5。免疫原免疫剂量与注射途径也密切相关，通常静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内注射剂量大。若使用免疫佐剂，可减少免疫原用量。依据所需抗体要求，可调整免疫原的注射量及注射次数，若要制备高特异性的多克隆抗体，可选用低剂量免疫原短程免疫法；若需获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。通常，免疫周期短时应多量少次，免疫周期长时应少量多次。若用血清作免疫原，即使是少量，在再次免疫时，极易引起超敏反应，一般需采取相应措施。

免疫原在动物体内的吸收及代谢与免疫途径有密切关系，免疫动物途径有多种，如皮下、皮内、腹腔、淋巴结、肌肉、脾脏及静脉接种。皮下与皮内接种免疫原时通常需多点注射，常接种10个点左右，主要部位为肘窝淋巴结周围、足掌、背部两侧、耳后部、颌下部等。皮内接种的免疫原易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。对极微量免疫原（10～100μg），多采用淋巴结内接种，在接种前通常用免疫佐剂进行预免疫，待淋巴结肿大后用微量注射器将免疫原直接注入淋巴结内。

动物体内抗体的产生遵循初次免疫应答和再次免疫应答规律，即初次接种免疫原后7～10天，动物血清中才有抗体产生，然后在14～21天达到顶峰，随后抗体效价开始下降。初次免疫应答后的一段时间内，若用相同免疫原再次刺激同一动物，则产生的抗体效价远高于初次免疫应答，抗体的类型也由IgM转变为IgG。因此制备抗体时应遵循动物体内抗体产生的规律，免疫原免疫动物的时间间隔应保持适宜，间隔太短起不到再次免疫的效果，太长则丧失前次激发的敏感时期。初次免疫后一般间隔10～20天进行再次强化免疫，其后的再次强化免疫时间间隔一般为7～10天，若加免疫佐剂者应以2周左右为宜。用半抗原进行免疫时，免疫时间间隔可适度延长。免疫原强化免疫的次数一般为3～5次。

在免疫动物前一般采集2～5ml血液，分离血清低温冷冻保存，以便日后进行抗体评价。在免疫动物后，采集抗血清前需进行抗体效价分析，以把握最佳采血时间。通常在第3次强化免疫后开始进行抗体效价监测，监测效价的方法为免疫双向扩散，抗体效价达1︰16以上即可采血。抗体效价高峰一般在第3～5次强化免疫期间，这期间采集的抗血清特异性也较高。当然，抗血清特异性主要取决于免疫原纯度。一旦抗血清效价达到高峰，可开始采集动物血液，采血过程需遵循动物伦理学原则。采集量依动物种类不同而异，如家兔一次可采集20～40ml血液，而绵羊一次可采300ml，若处死动物，可采集动物体内的全部血液。采血方法有3种：静脉采血、颈动脉采血及心脏采血。

家兔可选中央静脉采集，山羊、绵羊、马等可选用颈静脉采血，鼠则采取断尾或摘除眼球法采集。为了采集更多血液，一般隔几天采1次，如绵羊采血300ml后，应立即回输100g/L的葡萄糖生理盐水，3天后可再次采血，再隔7天进行一次加强免疫，仍可继续采血2次，这样一只绵羊最多可采血2000ml。

颈动脉采血是抗体制备的最常用采血方法，适合于绵羊、山羊及家兔等动物。采血前暴露颈部，然后切开皮肤，分离颈总动脉，插入采血器进行采血，也可剪断动脉直接放血于容器中。颈动脉采血要控制好采血速度，速度过快，动物会快速死亡，影响采血总量。

对于大鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、家兔等小动物，一般采用心脏采血。采血前先用食指触及动物胸壁，通过心脏搏动找准心脏位置，将针头以45°角刺入心脏，采集血液。

血液采集后应尽快分离血清，将血液置于室温使其自然凝固，然后置于37℃孵育1小时，再放于4℃冰箱过夜，使血凝块收缩，析出血清，这样既可保证抗体效价不降，也能尽量获得多的抗体。

经过纯化的免疫原也非单一成分，用它免疫动物后产生的是多种成分的混合物，既包括特异性抗体，也包括非特异性抗体，甚至其他成分。即使用高纯度免疫原，免疫动物后常产生抗κ轻链抗体、抗λ轻链抗体、抗γ重链抗体，这些非特异性抗体有时会出现与特异性抗体的交叉反应，因此需对获得抗血清进行纯化，分离特异性抗体，以满足生物学研究或实验诊断的要求。制备的单克隆抗体可为各种类型Ig，通过免疫动物获得的多克隆抗体一般为IgG类抗体，因此多克隆抗体的纯化通常先进行IgG类抗体纯化。

IgG类抗体纯化方法主要有3类：盐析法、离子交换层析及亲合层析。

盐析法一般采用硫酸铵溶液沉淀，先用20%硫酸铵沉淀血浆纤维蛋白原，再提升硫酸铵溶液至45%～50%沉淀IgG。盐析一般不引起蛋白变性，但沉淀中含有大量盐分，需进行脱盐处理。盐析法对抗体纯化的主要作用在浓缩，往往需结合其他方法如离子交换层析和亲合层析进一步纯化。

离子交换层析多用纤维素衍生物作离子交换剂，常用的有羧甲基纤维素（阳离子交换剂）和二乙胺基乙基纤维素（阴离子交换剂）。Ig类蛋白有较高等电点，等电点为8.6左右，而大部分蛋白等电点为6.0～7.0，血清白蛋白等电点则低于5.0。因此在pH为7.5时，Ig类蛋白全部带正电荷，使用阳离子交换剂填充层析柱，就可吸附带负电的蛋白，而带正电的IgG分子可直接过柱。离子交换层析纯化IgG类抗体方法简单，也不影响抗体活性。

亲合层析是利用金黄色葡萄球菌蛋白A可结合抗体分子恒定区特性，用金黄色葡萄球菌蛋白A与琼脂糖交联填充层析柱，当抗血清进行过柱时，IgG抗体可与金黄色葡萄球菌蛋白A结合，其他类蛋白则不能结合，用洗涤液洗涤可去掉未结合的其他类蛋白。然后改变洗脱液的pH和离子强度，即可洗脱Ig类抗体，得到纯化的IgG抗体。

特异性抗体的纯化一般通过与抗原结合进行纯化，主要途径有2种：亲合层析和吸附法。

亲合层析通常将提取的抗原或杂抗原交联到sepharose 4B制备的亲合层析柱，若用提取抗原交联层析柱，当抗血清进行过柱时，特异性抗体可与抗原结合，杂抗体则不能结合，用洗涤液先洗去，然后改变洗脱液的pH或离子强度，即可洗得纯化的特异性抗体。若用杂抗原交联层析柱，当抗血清进行过柱时，杂抗原被吸附在层析柱内，特异性抗体随洗脱液径直流出，收集过柱液即可获得特异性抗体。

吸附法主要是去除已知的非特异性抗体，通常将非特异性IgG抗体对应的抗原固化在固相介质上，当抗血清与固相介质孵育时，非特异性抗体被吸附在介质上而被去除，上清液即为特异性IgG抗体。

动物血清经分离及纯化后，会导致不同程度的活性丧失和效价降低，因此在使用或保存前需进行鉴定，鉴定内容包括抗体效价、抗体纯度、抗体特异性、抗体亲和力等。

效价测定可依据抗原性质不同而选用不同方法，如用凝集试验鉴定颗粒性抗原效价，酶联免疫吸附试验和双向免疫扩散试验测定可溶性抗原的效价。采用双向免疫扩散试验测定可溶性抗原效价时，既可稀释抗血清，也可稀释抗原，若沉淀线不易出现，可换用其他方法进行效价测定，如血凝试验、血凝抑制试验、中和试验等。

抗体纯度鉴定常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高压毛细管电泳、高效液相色谱等方法，其中以第一种方法较为常用。

抗体特异性是抗体只能与相对应的抗原反应，它是抗体最重要的特性。特异性分析是抗体鉴定的重要内容，双向免疫扩散试验是鉴定抗体特异性的常用方法。鉴定方法为用特异性抗原和相似抗原与抗血清进行双向免疫扩散，若存在交叉反应则显示抗血清中存在杂抗体。

亲和力是指抗体Fab片段与对应抗原决定簇间的结合强度，亲和力越高，对抗原结合力就越强，直接影响免疫测定的灵敏度。抗体亲和力鉴定的常用方法有酶联免疫吸附试验、平衡透析法等。

经鉴定为质量合格的抗体，一般先经56℃、30分钟灭活补体后加入适当防腐剂分装保存。防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、甘油等，防腐剂终浓度依次分别为0.01%、0.1%、50%。冻存温度为-80～-20℃，抗体效价可保存2～3年不变。若需保存更长时间，一般需冷冻干燥保存，保存年限在5年以上。不管何种方式保存抗体，均要避免反复冻融。

单克隆抗体是由单一克隆杂交瘤细胞所产生的、仅识别某一特定抗原决定簇的同源抗体。1975年Kohler和Milstein首先将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合建立具有永生性的、B细胞来源的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株可以产生单一特异性抗体，即单克隆抗体。单克隆抗体具有理化性质高度均一、特异性强、容易获得、无血清蛋白的交叉反应、可大量制备等特点，已被广泛应用于生命科学研究、疾病诊断与治疗等领域。目前单克隆抗体基本都为鼠源的，兔源单克隆抗体也已商品化，人源单克隆抗体已开始研制。直接免疫人体并不现实，也有违伦理学原则，因此人源杂交瘤细胞的永生性主要通过病毒感染产生。

杂交瘤细胞是由B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而成。单纯的B淋巴细胞可产生单克隆抗体，但它不具有永生性，无法长期稳定产生单克隆抗体。骨髓瘤细胞具有永生性，但不具有产生抗体的功能。杂交瘤细胞将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞与具有永生性的骨髓瘤细胞融合为B细胞淋巴瘤，因此杂交瘤细胞既具有合成和分泌特异性单克隆抗体的能力，又保留了骨髓瘤细胞在体外可无限增殖的特点。因此可利用杂交瘤细胞制备大量的特异性单克隆抗体。

细胞的DNA合成有2条途径：主要途径和补救途径。

在叶酸的参与下，由糖分子和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA分子。

经次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase，TK）的催化，次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA分子。杂交瘤细胞筛选一般选用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶（hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT）培养基，HAT培养基含有氨基蝶呤，而氨基蝶呤为叶酸拮抗剂，可阻断细胞内DNA合成的主要途径。小鼠骨髓瘤细胞虽具有TK酶，但缺乏HGPRT酶，不能通过补救途径利用次黄嘌呤合成DNA，同时DNA合成的主要途径也被抑制，因此相互融合的骨髓瘤细胞就会死亡。脾B淋巴细胞相互融合虽具有HGPRT酶，在DNA合成主要途径被阻断时能利用补救途径合成DNA，但由于脾B淋巴细胞不具有永生性，在HAT培养基中培养1周也会死亡。只有小鼠骨髓瘤细胞与脾B淋巴细胞融合成的杂交瘤细胞在HAT培养基中既能存活，又能增殖。

单克隆抗体制备的前提是获得杂交瘤细胞，然后选择能产生抗体的杂交瘤细胞进行克隆培养，产生大量的单克隆抗体。具体过程包括亲本细胞的筛选和融合、培养细胞的制备、小鼠骨髓瘤细胞与脾B淋巴细胞的融合、HAT选择性培养基的应用、抗原特异性杂交瘤细胞的筛选与克隆，以及杂交瘤细胞的冻存与复苏。

骨髓瘤细胞为永生的B细胞系恶性肿瘤细胞，能在体外长期增殖，能与脾B淋巴细胞融合的骨髓瘤细胞应具备如下要求：①细胞株稳定且易于培养；②细胞株自身不分泌免疫球蛋白或细胞因子；③细胞株为HGPRT酶缺陷株；④与脾B淋巴细胞融合率高且融合细胞株稳定。常用的骨髓瘤细胞株有SP2/0细胞和NS1细胞，以前者最常用。致敏B淋巴细胞选择步骤为：①用免疫原免疫与骨髓瘤细胞来源鼠同源的小鼠，免疫原需具有高纯度、高活性，可溶性免疫原可选皮内或腹腔接种，且需加弗氏完全佐剂；颗粒免疫原一般通过腹腔接种；②检测抗体效价，达到要求后摘取小鼠脾脏，分离脾B淋巴细胞。细胞融合是制备单克隆抗体最关键的步骤，融合方法有物理法（电场诱导或激光诱导）、化学法（聚乙二醇介导）、生物法（仙台病毒感染）等，以聚乙二醇介导的化学法最常用。聚乙二醇可使细胞膜上脂类物质结构重排，从而产生融合，一般分子量为1000～4000的聚乙二醇均可做细胞融合剂，融合剂浓度为30%～50%。各实验室具体融合方法不尽相同，但需控制好细胞比例、融合反应时间。

聚乙二醇促进细胞融合并无选择性，是一个随机的过程，在杂交瘤细胞制备过程中，它可促进脾细胞间融合、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合、骨髓瘤细胞间融合、细胞多聚体。脾细胞及其细胞多聚体在培养基中存活几天即会死亡。骨髓瘤细胞及其细胞多聚体在HAT选择性培养基中因缺乏HGPRT酶也会逐渐死亡。只有脾细胞与骨髓瘤细胞融合成的杂交瘤细胞可在HAT培养基中持续增殖生长。

用来免疫动物的免疫原一般有多个抗原决定簇，它免疫动物后可产生针对不同抗原决定簇的多种单克隆抗体，因此要获得特定的单克隆抗体，需对杂交瘤细胞进行筛选。筛选抗原特异性杂交瘤细胞有克隆细胞有限稀释法和流式细胞分选法。克隆细胞有限稀释法是将杂交瘤细胞进行稀释，使每孔仅含一个细胞，然后进行增殖培养，最后检测各孔培养液中的抗体，能与特异性抗原反应的孔中细胞即为阳性克隆细胞，为了获得高度特异性的单克隆抗体，一般进行3～4次稀释，以确保筛选的细胞为真正阳性的抗原特异性杂交瘤细胞。流式细胞分选法是通过基因修饰，使杂交瘤细胞表达除特异性抗体外，还可表达一种标记膜抗体，通过流式细胞仪对抗原特异性阳性杂交瘤细胞进行分选，能显著缩短杂交瘤细胞的筛选时间。

筛选得到的抗原特异性杂交瘤细胞应尽快液氮冻存，以免细胞出现死亡、被污染，或丧失抗体分泌能力。若杂交瘤细胞冻存时间较长，需定期复苏检查细胞的活性及抗体分泌能力。杂交瘤细胞复苏时需立即放于37℃水浴中解冻，然后用细胞培养液洗涤细胞2次，再转种于已铺好饲养细胞层的培养瓶中，饲养细胞一般选用小鼠腹腔细胞，饲养细胞可促进杂交瘤细胞的生长，等杂交瘤细胞进入增殖期后，饲养细胞就会自然死亡。

单克隆抗体大量制备的方法有二：动物体内诱生法和体外细胞培养法（图2-2）。在筛选到阳性杂交瘤细胞后，一般应尽快制备单克隆抗体，以防细胞死亡或被污染。

通常选用与杂交瘤细胞来源相同背景的遗传小鼠如Balb/c鼠制备抗体，在接种杂交瘤细胞前，注入免疫佐剂，一周后将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱生腹腔肿瘤，形成腹水，用注射器抽取腹水，离心取上清液即可获得单克隆抗体。间断收集腹水，直至小鼠死亡，以获得大量抗体。动物体内诱生法是制备单克隆抗体的主要方法，其抗体效价远高于体外细胞培养法获得的抗体。

将杂交瘤细胞接种于培养瓶中进行培养，杂交瘤细胞在培养过程中不断分泌抗体至培养液中，离心去除沉淀，上清液中即含有单克隆抗体。通过体外细胞培养法获得的抗体量少、效价低，一般适用于实验室自用。

通过动物体内诱生法和体外细胞培养法制备的单克隆抗体一般含有脂类物质及细胞成分，通常可通过二氧化硅吸附或过滤离心等方法去除，然后依据用途和抗体纯度要求不同，采用不同方法进行纯化。单克隆抗体纯化方法与抗血清基本相同，主要纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲合层析法等，最有效的方法为亲合层析法。纯化后的单克隆抗体需进行性质鉴定，鉴定的指标包括效价、特异性、Ig类型、亲和力等。

抗体效价通常以稀释度表示，稀释度越高，则抗体效价越高。抗体效价可通过凝集反应、放射免疫测定、酶联免疫吸附试验等确定。以腹水为例，凝集反应可达1︰50 000以上，酶联免疫吸附试验可达1︰1 000 000以上。

用特异性抗原和相关抗原鉴定单克隆抗体的特异性。与特异性抗原发生反应，与相关抗原无交叉反应，显示抗体具有特异性。鉴定方法有免疫荧光、酶联免疫吸附、间接血凝、放射免疫等。

鼠源单克隆抗体的Ig类型主要有IgG、IgM、IgA，IgG亚类有IgG ₁、IgG _2a、IgG _2b、IgG ₃等，鉴定型及亚类需用标准抗型、亚类血清，鉴定方法有免疫琼脂双向扩散法、夹心酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法等。

一般用酶联免疫吸附试验和平衡透析法鉴定单克隆抗体的亲和力。

单克隆抗体是单个杂交瘤细胞产生的高度均一的抗体，只针对单一抗原决定簇，具有高度特异性，因此发生交叉反应的概率极小，具有独特优势。单克隆抗体仅与一个抗原决定簇结合，很难形成三维晶格结构，故难以形成肉眼可见的沉淀反应，产生凝集反应也很弱。单克隆抗体对环境有较高敏感性，易受pH、盐类浓度、温度等条件的影响，环境条件改变时，其活性会降低，甚至丧失。鉴于单克隆抗体的独特优势，其已被广泛应用于生命科学和医学领域。在医学领域的应用有生产临床诊断试剂、进行蛋白纯化、肿瘤靶向治疗、影像学诊断。

单克隆抗体高度均一、特异性强、纯度高，已被应用于免疫组化、流式细胞分析、酶联免疫吸附试验等诊断试剂。

以单克隆抗体为配体，交联到琼脂糖制备层析柱，可通过亲合层析法纯化特异性蛋白质。

将肿瘤治疗药物交联到针对肿瘤抗原的单克隆抗体上，当单克隆抗体结合到肿瘤抗原上时，药物可选择性杀伤肿瘤细胞。

将放射性核素结合到针对肿瘤抗原的单克隆抗体上，注入病人体内，当单克隆抗体与肿瘤抗原结合时，可对肿瘤大小及定位进行辅助诊断。

尽管鼠源单克隆抗体有广泛用途，但它不能识别一些抗原，尤其是鼠源抗原，另一方面，鼠源抗体不及兔源抗体的亲和力高。由于没有兔浆细胞瘤，体外病毒感染兔浆细胞瘤存在困难，相当长时间内，兔单克隆抗体制备没有成功。1995年Katherine Knight博士成功地在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤，后经Robert Pytela博士等进一步改进，获得了能产生兔单克隆抗体的兔浆细胞瘤。兔单克隆抗体具有一些鼠单克隆抗体不具备的优点：①更高的亲和力，能识别的抗原决定簇谱更广；②能识别一些在鼠体内不能产生免疫应答的免疫原；③由于兔脾脏大，可供融合的细胞更多，可通过高通量筛选融合细胞；④兔单克隆抗体比鼠单克隆抗体更易人源化。因此，兔单克隆抗体制备成功弥补了鼠单克隆抗体的不足。目前Epitomics公司独家拥有兔单克隆抗体技术专利，开发了一些用于科研、诊断和治疗的兔单克隆抗体。

目前制备的抗体多为鼠源或兔源，对人来言，它们是异种抗原，多次注射可使人产生抗鼠或抗兔抗体，进行治疗时效果会减弱或失去疗效，并增加了超敏反应发生的概率。因此30年前，研究人员开始利用基因工程制备抗体，以期降低鼠源抗体的免疫原性。基因工程抗体也称重组抗体，是利用重组DNA技术及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工、改造和重新装配，再转染适当的受体细胞而表达的抗体分子。相对于多克隆抗体及单克隆抗体，基因工程抗体，称为第3代抗体。目前已制备成功的基因工程抗体有人源化抗体、小分子抗体、双特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体库技术、重组多克隆抗体等。

人源化抗体指利用基因克隆及DNA重组技术对制备鼠单克隆抗体的抗体基因进行改造，其中大部分鼠源的氨基酸序列被人源序列取代，既保留了鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利于临床应用。人源化抗体主要有嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体、完全人源化抗体。

通过DNA重组将杂交瘤细胞中分离的鼠源单克隆抗体的V区基因与人IgG的C区连接成嵌合基因，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，嵌合抗体近2/3序列是人源的，它既有鼠单克隆抗体V区特异结合抗原的能力，又有人抗体的C区功能，减少了异源抗体的免疫原性，又同时保留了鼠单克隆抗体的特异性抗原结合能力。

嵌合抗体的免疫原性显著低于鼠单克隆抗体，但V区基因表达的氨基酸序列仍可诱导一定程度的人抗鼠抗体反应。为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，通过基因工程将鼠源单克隆抗体的互补决定区（complementarity determining region，CDR）取代嵌合抗体的V区，这样产生的人源化抗体称为改型抗体，也称CDR植入抗体。改型抗体中鼠源序列占极少部分，对人几乎没有免疫原性，但改型抗体结合抗原的能力会下降。通过在人源骨架区引入鼠源的某些关键残基，可部分提高抗体亲和力。

是对鼠单克隆抗体表面的氨基酸残基进行人源化改造，仅替换那些与人源抗体结构活力相关（structure-activity relationship，SAR）区存在明显差异的区域，在保持抗体活性并兼顾减少异源性基础上，选用与人源抗体表面序列相似的氨基酸替换；所替换的区域不宜过多，以免影响侧链大小、电荷、疏水性等，对可能形成氢键而影响抗体CDR区构像的残基尽量保持不变。

将人Ig基因取代鼠Ig基因，以免疫原免疫动物，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。

指通过基因重组技术表达的、可结合抗原的小分子片段。小分子抗体有抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）、可变区片段（fragment of variable，Fv）、单链可变片段（single-chain fragment of variable，ScFv）、重链抗体（heavy-chain antibody，HcAb）、单区抗体（single-domain antibody，SdAb）、超变区多肽（hypervariable region polypeptides，HVRPP）、微型抗体（minibody）等。小分子抗体在应用时具有许多优势，如：①穿透力强：小分子抗体分子小，容易穿透血管到达组织细胞，可用于免疫治疗；②容易制备：小分子抗体可通过原核细胞如大肠埃希菌表达，制备成本低；③免疫原性弱：小分子抗体仅含鼠源单克隆抗体的V区基因，免疫原性比原鼠源单克隆抗体低得多；④不激活补体：小分子抗体不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不激活补体，能集中到达靶细胞，提高靶向药物治疗的疗效；⑤半衰期短：小分子抗体易降解，半衰期短，有利于肿瘤的影像学检查。

Fab由1条完整的轻链（L链）和近1/2重链（H链）（VH和CH1）组成，具有与完整抗体分子相同的抗原结合特性，但仅有1个抗原结合位点。Fab小分子抗体仅有天然IgG分子的1/3，主要功能是结合抗原。

Fv是由1条L链V区和1条H链V区以非共价键结合组成的单价小分子，是保留抗原结合部的最小功能片段，仅有天然IgG分子的1/6，将VL和VH区的cDNA转化大肠埃希菌可以表达V _L链和V _H链，获得有功能的Fv。在低浓度时，Fv易分解为V _L链和V _H链，因此可用戊二醛将V _L链和V _H链交联；或在适当位点引入半胱氨酸残基，使V _L链和V _H链间形成二硫键。

可通过基因工程引入一个10～25氨基酸残基的连接短肽将Fv分子V _L链和V _H链连接成小分子抗体，这种小分子抗体称为ScFv。设计连接短肽时，尽量引入甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸，使短肽具有柔韧性和良好的可溶性。ScFv分子稳定，分子量较低，穿透力强，免疫原性低，可与其他效应分子组成多种有新功能的抗体分子，如在ScFv基础上可进一步构建双链抗体、三链抗体、四链抗体等。

HcAb是缺失两条L链的H链二聚体。天然IgG抗体一般是两条L链和两条H链组成的异型四聚体，但也存在二聚体IgG分子，如骆驼血清中的IgG ₂和IgG ₃分子均为2条H链组成的同型二聚体，是天然的HcAb分子。可通过基因工程保留抗原结合活性的重链抗体可变区，它仅含可变区、CH2区、CH3区，即SdAb。SdAb仅为天然IgG分子的1/12，耐热，且对变性剂稳定。两条单域重链抗体组成HcAb。HcAb在生命科学研究、抗体药物、疾病诊断与治疗等方面有广泛的应用前景。

仅含一个能识别抗原、并具有高亲和力的CDR多肽抗体称为HVRPP，是抗原最小识别单位，HVRPP可直接应用于疾病的诊断与治疗。

使用接头将ScFv的H链V区与IgG分子的CH3区连接起来称为微型抗体，微型抗体具有VL-VH-CH3结构，两个微型抗体分子可通过CH3结构域形成稳定的二聚体。

能同时与两种不同性质抗原结合的抗体分子称为双特异性抗体。双特异性抗体分子能同时结合2个不同的抗原分子，在不同细胞或分子间架起桥梁，激发定向免疫反应，因此双特异性抗体也称为双功能抗体分子。双特异性抗体的制备方法有化学偶联法、杂交瘤法、基因工程抗体制备法，以后者最为常用。基因工程制备双特异性抗体的原理是通过对小分子抗体基因进行修饰，在同一载体上将两种特异性的ScFv cDNA用连接器首尾相连，使其在细胞内表达一条长的肽链，经修饰折叠后形成双特异性抗体。双特异性抗体的制备可以省去传统抗原抗体反应的酶标记，直接将酶引入抗原抗体反应中。双特异性抗体在肿瘤放射免疫显像、肿瘤的靶向药物治疗中有广泛的应用前景。

抗体融合蛋白是通过基因工程将表达单克隆抗体的cDNA与另一种生物活性蛋白的基因融合起来，再导入适当的细胞进行表达，表达的抗体融合蛋白既具有单链抗体的抗原结合能力，又有另一种融合蛋白原有的生物活性。常用的抗体融合蛋白融合的抗体分子片段主要有Fab、Fv、Fc等。

将单克隆抗体Fab段与病原体特定蛋白进行融合，可制备临床诊断试剂。如用抗人红细胞单克隆抗体Fab段与HIV病毒的gp41蛋白进行融合，可建立自体红细胞凝集试验对HIV感染进行筛查，当病人体内存在抗HIV抗体时，红细胞可出现凝集反应。

将单克隆抗体Fv段与细胞因子或毒素蛋白融合，可引导细胞因子或毒素蛋白聚集在靶细胞部位，使其在局部发挥生物学活性，降低细胞因子或毒素蛋白在治疗疾病时的毒副作用。

将单克隆抗体Fc段与生物活性蛋白融合，可延长生物活性物质在体内的半衰期，同时与抗体Fc段结合也有助于生物活性蛋白的靶向治疗。

抗体库技术是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆到质粒或噬菌体中表达，利用不同抗原筛选出携带特异性抗体基因的克隆，从而制备出相应的特异性抗体。抗体库技术本质上是利用细菌克隆替代B淋巴细胞克隆来获得特异性抗体。抗体库技术包括克隆出抗体全套可变区基因，连接到相关载体，导入大肠埃希菌，利用大肠埃希菌表达具有抗原结合功能的抗体分子片段。可变区基因克隆方法是利用一套引物通过PCR技术扩增出全套免疫球蛋白可变区基因，抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有一些杂交瘤技术难以相比的优势：①抗体库技术模拟天然抗体库，库容几乎包含所有的抗体，无需免疫动物；②利用相关抗原直接从非免疫动物的抗体库中筛选出特异性抗体，同时能筛到针对该动物自身抗原的抗体；③利用抗体库技术可直接筛到人源单克隆抗体，克服了杂交瘤技术制备人源抗体的免疫原性；④细菌较杂交瘤细胞容易培养，繁殖快，培养成本低，容易获得大量高纯度抗体。抗体库技术经历了组合抗体库、噬菌体抗体库及核糖体展示抗体库3个阶段。噬菌体抗体库是技术成熟、应用最广泛的抗体库技术。

组合抗体库是通过RT-PCR技术分别从淋巴细胞中克隆免疫球蛋白L链全套可变区基因和H链Fd段的全套可变区基因，分别构建到噬菌体载体中进行表达。组合抗体库在很短时间内就被噬菌体抗体库所取代。

噬菌体抗体库技术是利用PCR扩增抗体整套可变区基因，将抗体分子DNA片段如ScFv、Fab与噬菌体外壳蛋白PⅢ或PⅧ链接，融合蛋白表达于噬菌体外壳表面，经“吸附-洗脱-扩增”筛选富集特异性抗体。依据构建噬菌体抗体库的抗体基因来源不同，可将噬菌体抗体库分3类：天然抗体库、免疫抗体库、合成抗体库。天然抗体库的抗体基因来源于未经免疫的动物或人体B淋巴细胞，因未经免疫原刺激，所筛选的抗体亲和力相对较低。免疫抗体库的抗体基因来源于经过免疫原刺激的分化浆细胞和记忆性B细胞，免疫抗体库筛选的抗体亲和力较天然抗体库高，但应用范围变小。合成抗体库的抗体基因部分来源于人工合成的抗体可变区基因序列，部分来源于天然抗体基因序列，合成抗体库的抗体基因也可全部来源人工合成的抗体可变区序列。

核糖体展示抗体库是在多聚核糖体展示技术基础上发展而来，它是将正确折叠的蛋白与其mRNA同时结合在核糖体上，形成mRNA-核糖体-蛋白质聚合体，使蛋白的基因型和表型结合起来的一种抗体库技术。核糖体展示抗体库完全在体外进行，文库量不受细胞转染效率的影响，利用功能性蛋白质进行筛选，极大提高了文库的库容量和筛选效率。核糖体展示抗体库技术可应用于单链抗体的构建。

单克隆抗体对肿瘤及自身免疫性疾病的治疗有明显疗效，但对微生物感染的治疗效果欠佳，因为其疗效与激活或阻断的下游信号相关，不能覆盖自然免疫的所有效应器。病原微生物一般有复杂的抗原决定簇，研究已显示用几种不同单克隆抗体治疗时，会呈现协同效应，因此重组多克隆抗体对治疗微生物感染有优势。制备重组多克隆抗体的前提是构建人抗体库，多采用PCR技术扩增人抗体的L链和H链基因，通过噬菌体和核糖体表达展示抗体，再用抗原筛选特异性抗体基因。制备重组多克隆抗体的一项关键技术是位点特异性整合技术，它是依靠重组酶识别基因组中特异位点的特殊序列，通过同源重组将抗体基因插入特异位点，避免抗体基因在基因组中的随机整合，使各抗体基因的表达水平稳定而无明显差异，抗体基因的遗传稳定性有助于保证重组多克隆抗体制备的一致性。重组多克隆抗体兼有多克隆抗体和单克隆抗体的优点，在感染性疾病和肿瘤治疗中有较好的应用前景。

基因工程抗体是结合DNA重组和蛋白质工程技术制备的一种新型抗体，这种抗体去除了天然抗体的免疫原结构，保留了其抗原结合特性和抗体特异性。因此基因工程抗体在研究和临床应用中有独特优势。基因工程抗体在临床应用主要是作为抗体药物和诊断试剂。

将肿瘤抗原的相关抗体与一些功能分子如细胞毒性药物、毒素、酶、小分子肽、放射性核素等构建成融合蛋白，可对肿瘤的诊断及靶向治疗起到导向作用，减少功能分子的毒性作用。若将与病原微生物抗原的相关抗体与多肽药物融合，可选择性对病原微生物进行清除。

将基因工程抗体与酶蛋白构建成融合蛋白，可组成双功能免疫诊断试剂。基因工程抗体在影像分析中具有两大优势，首先抗体携带放射性物质结合到肿瘤抗原，使放射性物质聚集到肿瘤组织成像，起到定位诊断作用；另一方面，通过基因重组使得抗体分子小，穿透力好，能快速清除，使显像诊断时间短，副作用小。